Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объёма исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ).
Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений; посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
1. Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде, жидкой питательной среде или в 0,85%-м растворе NaCl (физиологическом растворе). Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 см3 в стерильные сухие пробирки. Затем 1 см3 исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см3 стерильной воды – это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 см3 суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10-2). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.
Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата вследствие высокой способности клеток микроорганизмов к сорбции на поверхности стекла.
2. Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 – 20 см3 в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 см3) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2 – 4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 см3) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45 – 50 °С среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 см3 из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2 – 4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15 – 20 см3 среды, расплавленной и остуженной до 45 – 50°С, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.
Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат.
3. Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1 – 15 сут инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.
Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 – 50 до 100 – 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке (рис.3).
Рис. 3. Схема приготовления разведений и высева в чашки Петри
Количество клеток в 1 см3 исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
M =
где M – количество клеток в 1 см3; a – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспензии, взятый для посева, см3; 10n – коэффициент разведения.
Задание:
1. Приготовить к стерилизации физиологический раствор: разлить по 9 см3 в пробирки (по 7 пробирок на каждого студента), закрыть ватно-марлевыми пробками.
2. Подготовить чашки Петри (по 3 чашки Петри на каждого студента), пипетки (8 пипеток на 1 см3 на каждого студента) к стерилизации.
3. Приготовить питательную среду типа ГРМ-агар для стерилизации.
4. Произвести количественный учет бактериальной культуры, предварительной выращенной на жидкой питательной среде.
Актиномицеты.
