Принцип методу. Метод базується на окисненні гідроксипроліну до сполуки, близької за будовою до піролу, яка при конденсації з реактивом Ерліха (п-диметиламінобензальдегід) дає рожеве забарвлення. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації гідроксипроліну.
Матеріальне забезпечення: реактив Ерліха, 3 н розчин сульфатної кислоти, 6% розчин водню пероксиду, 2,5 н розчин натрію гідроксиду, 0,01 М розчин міді сульфату, водяна баня, ФЕК, мірні піпетки, пробірки, лійка, фільтрувальний папір.
Хід роботи: У першу пробірку відмірюють 1мл профільтрованої сечі, в другу – 1мл дистильованої води (контрольна проба). В обидві пробірки додають по 1мл 0,01 М розчину міді сульфату, по 1 мл 2,5 н розчину натрію гідроксиду, по 1мл 6% розчину водню пероксиду. Проби перемішують 5 хв, після чого нагрівають 3 хв у киплячій водяній бані, а потім пробірки охолоджують водою з крану. У пробірки додають по 4мл 3 н розчину сірчаної кислоти і по 1мл реактиву Ерліха, ставлять на 1 хв у киплячу водяну баню, охолоджують, а потім вимірюють оптичну густину на ФЕКу проти контролю при довжині хвилі 500 – 560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі завтовшки 10 мм.
За калібрувальним графіком визначають вміст гідроксипроліну в дослідній пробі і розраховують кількість гідроксипроліну, виділеного з сечею впродовж доби за формулою:
,
де а – кількість гідроксипроліну, знайдена за калібрувальним графіком; V доб. – добовий об’єм сечі мл; V проби – об’єм сечі, взятий для аналізу, мл.
Крива залежності оптичної густини розчину гідроксипроліну від його концентрації
Пояснити отриманий результат. Зробити висновок
Клініко-діагностичне значення. Гідроксипролін – це амінокислота, яка характерна для білків сполучної тканини – колагену (містить 12-14 %) і еластину (1-2 %). Саме вміст гідроксипроліну в сечі та крові характеризує інтенсивність катаболізму колагену та швидкість обміну цієї амінокислоти. Гідроксипролін може знаходитись у стані, зв’язаному з білками, пептидами, а також у вільному стані як у сироватці крові, так і в сечі. У віці людини 10 – 20 років з сечею виділяється до 200 мг гідроксипроліну за добу, а у дорослих – 15-50 мг. Зростання цього показника спостерігають при колагенозах (ревматизм, ревматоїдний артрит, системна склеродермія, дерматоміозит), при гіперпаратиреоїдизмі, хворобі Педжета (до 1 г за добу). Ще більше виділяється гідроксипроліну при спадковій гіпергідроксипролінемії, що спричинено дефектом ферменту гідроксипролін-оксидази, в результаті чого порушується обмін гідроксипроліну.
