Дослід 2. Визначення залишкового азоту крові (метод Боданського).

Принцип методу. Залишковий азот крові визначають у безбілковому фільтраті після осадження білків крові; безбілковий фільтрат мінералізують концентрованою сульфатною кислотою. При цьому азот всіх азотовмісних сполук у вигляді аміаку зв’язується з сульфатною кислотою і утворює амонію сульфат, який з реактивом Несслера утворює сполуку жовто-оранжевого кольору. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації азоту.

Матеріальне забезпечення: кров, 10 % розчин трихлорацетатної кислоти, сульфатна кислота концентрована, гідрогену пероксид концентрований, 12,5 М розчин натрію гідроксиду, реактив Несслера, стандартний розчин (1 мл розчину амонію сульфату містить 0,05 мг азоту), лакмусовий папір, мікропіпетки, ФЕК, термостійкі пробірки.

Хід роботи:

1. Отримання безбілкового фільтрату.

У центрифужну пробірку наливають 2,8 мл 10 % розчину трихлорацетатної кислоти і 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують, залишають на 15 хв і центрифугують.

2. Мінералізація.

У пробірку з тугоплавкого скла вносять 0,5 мл центрифугату, добавляють 0,05 мл концентрованої сульфатної кислоти. Спалювання здійснюють на пісочній бані. При спалюванні пробірка повинна торкатися тільки верхнього шару піску. Спочатку випаровується вода – досліджувана рідина буріє. Пробірку знімають з бані, дають їй охолонути, добавляють у пробірку 2 краплі гідрогену пероксиду концентрованого і знову ставлять для спалювання до знебарвлювання рідини. Слід перевірити колір рідини у пробірці після її охолодження, оскільки часто рідина, яка здається безбарвною у гарячому стані, при охолодженні темнішає.

Після охолодження в пробірку добавляють 10 мл свіжокип’яченої дистильованої води і нейтралізують 12,5 М розчином натрію гідроксиду до слабколужної реакції. Реакція визначається за зміною кольору лакмусового папірця з червоного кольору на синій. Надлишок лугу при нейтралізації призводить до помутніння розчину. Нестача лугу викликає випадання солей меркурію з реактиву Неслера і дослід вважається зіпсованим.

Кольорова реакція (несслеризація). У пробірку добавляють 0,5 мл реактиву Несслера (К₂HgІ₄), внаслідок чого вміст пробірки забарвлюється у жовтий колір різної інтенсивності залежно від вмісту азоту:

2 К₂HgІ₄ + 3 KOH + NH₃ O NH₂І + 7 KІ + 2 H₂O

комплексна сполука

Одночасно з дослідною пробою обробляють стандартну пробу: 0,2 мл стандартного розчину, 0,05 мл концентрованої сульфатної кислоти, 0,3 мл 12,5 М натрію гідроксиду, 0,5 мл реактиву Несслера і 9,8 мл дистильованої води. Дослідну і стандартну проби спектрофотометрують порівняно з контролем на реактиви при довжині хвилі 440 – 450 нм (фіолетовий світлофільтр) у кюветі товщиною 0,5 см.

Контроль ставлять як стандартні проби, але замість стандартного розчину амонію сульфату добавляють воду. Контрольні проби повинні мати легкий жовтуватий відтінок. Більш насичений колір контролю свідчить про наявність у дистильованій воді азоту (аміаку).

Розрахунок проводять за формулою:

Cд = Сст _* (Ад/Аст) = 21,42 Ад/Аст,

де Сд – концентрація залишкового азоту в досліді, ммоль/л;

Ад – екстинкція дослідної проби;

Сст – концентрація залишкового азоту в стандарті (С ст = 21,4 ммоль/л);

Аст – екстинкція стандартної проби.

Норма. Вміст залишкового азоту в крові становить 14,3 – 25 ммоль/л, (20 – 35 мг %). Коефіцієнт перерахунку з мг/100 мл у ммоль/л – 0,714.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Визначення небілкового азоту і його окремих компонентів проводиться з метою: діагностики порушень видільної функції нирок та оцінки ступеня ниркової недостатності; оцінки сечовиноутворюючої функції печінки і виявлення печінкової недостатності; оцінки кількісних змін середніх молекул, які накопичуються в організмі при різних захворюваннях, що супроводжуються ендогенними інтоксикаціями.

Для початкових стадій деяких захворювань характерно не стільки підвищення залишкового азоту крові взагалі, скільки зміни у кількісному вмісті компонентів залишкового азоту, співвідношенням між ними та загальним азотом.

Ретенційна (ниркова) азотемія зустрічається при гломерулонефритах, пієлонефриті, туберкульозі та амілоїдозі нирок. Позаниркові ретенційні азотемії зумовлені порушенням гемодинаміки і, відповідно, зниженням клубочкової фільтрації. Вони виникають у результаті серцево-судинної декомпенсації, при локальному порушенні кровообігу в ниркових артеріях. Продукційна азотемія спостерігається при кахексії, лейкозах, новоутвореннях, кишковій непрохідності, лікуванні глюкокортикоїдами. Азотемія зустрічається у недоношених дітей.

Зменшення вмісту залишкового азоту спостерігається при недостатньому харчуванні, зокрема білковому, тяжкій печінковій недостатності, некрозі печінки, іноді при вагітності.