Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ќсновные методы качественного и количественного анализа биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье




 

—овременна€ нормативна€ документаци€ на лекарственное растительное сырьЄ в качестве одного из важнейших показателей об€зательно включает обнаружение и нормирование содержани€ основных биологически активных веществ. »х определение проводитс€ с использованием химических, физико-химических и биологических методов.

јнализируема€ группа веществ или индивидуальное вещество предварительно извлекаютс€ из растительного сырь€. „аше всего используют экстракцию растворител€ми, в результате которой получают смесь компонентов; затем провод€т очистку от примесей, дел€т на отдельные фракции и/или выдел€ют индивидуальные вещества, использу€ преимущественно хроматографические методы.

ƒл€ анализа эфирных масел используют перегонку с вод€ным паром. —одержание эфирного масла в растительном сырье определ€етс€ способами, описанными в √‘ XI, вып. 1.  оличество перегнанного масла измер€ют с помощью специальных устройств и рассчитывают в весо-объЄмных процентах.

  химическим можно отнести методы анализа, в основе которых лежат химические реакции. ƒл€ идентификации действующих веществ используют групповые цветные и осадительные химические реакции.   традиционным методам количественного химического анализа относ€тс€ гравиметрические и титриметрические методы.

√равиметрический (весовой) анализ основан на выделении суммы веществ путЄм их осаждени€ из различных растворителей или за счЄт получени€ нерастворимых комплексных соединений и последующем установлении массы взвешиванием осадка на аналитических весах (например, определение полисахаридов в листь€х подорожника и траве череды).

“итриметрические (объЄмные) методы весьма разнообразны и завис€т от химических свойств исследуемых соединений. ƒл€ этих целей используютс€ методы пр€мого и обратного титровани€. ¬ основу титриметрических методов могут быть положены реакции следующих типов: кислотно-основные, окислительно-восстановительные, реакции осаждени€ и образовани€ комплексных соединений. ƒл€ некоторых оснований и кислот, титрование которых в воде затруднено или невозможно из-за слабых кислотно-основных свойств или малой растворимости (например, некоторые алкалоиды, аминокислоты и пр.), провод€т определение в неводных растворах. Ўироко распространены методы титровани€ окислител€ми Ч перманганатометри€ (определение дубильных веществ в сырье), йодометри€ (определение арбутина в листь€х толокн€нки и брусники) и др. “очку эквивалентности фиксируют с помощью цветных индикаторов или потенциометрически (за счЄт скачка потенциала индикаторного электрода). ѕотенциометрическое титрование в анализе лекарственного растительного сырь€ используетс€ сравнительно редко, например при количественном определении суммы аралозидов в корн€х аралии маньчжурской.

—овременные физико-химические методы анализа имеют р€д преимуществ перед классическими химическими методами. Ќа сегодн€шний день существует большое количество аналитических приборов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами и позвол€ющих анализировать практически любые органические соединени€, содержащиес€ в природных объектах. ќни отличаютс€ избирательностью, высокой чувствительностью, высокой степенью автоматизации.

  наиболее широко распространЄнным в насто€щее врем€ современным методам анализа растительного сырь€ относ€тс€ хроматографические методы и методы фотометрического анализа. ¬ажнейшей особенностью этих методов €вл€етс€ объективность оценки количественного содержани€ фармакологически активных веществ, что, в свою очередь, определ€ет качество растительного сырь€.

’роматографические методы анализа используютс€ дл€ разделени€ смеси веществ или частиц (например, ионов) и основаны на различии в скорости их перемещени€ в системе несмешивающихс€ и движущихс€ относительно друг друга фаз. ѕоэтому хроматографи€ примен€етс€ как на этапе пробоподготовки (очистки анализируемого компонента или смеси компонентов от сопутствующих примесей), так и в ходе непосредственного качественного и количественного анализов. ѕри этом идентификаци€ компонентов проводитс€ по параметрам их удерживани€ в сравнении со стандартными образцами (свидетел€ми). ќпределение содержани€ искомых соединений или их групп в исходной смеси после хроматографического разделени€ проводитс€ другими физико-химическими методами в зависимости от способа детекции.

ѕо механизму разделени€ различают следующие виды хроматографии, примен€емые в анализе лекарственного растительного сырь€.

јдсорбционна€ хроматографи€, в основе которой лежит непрерывный обмен хроматографируемым веществом между неподвижной (твЄрдой или жидкой) и подвижной фазами, обусловленный существованием на поверхности раздела фаз динамического равновеси€ между процессами адсорбции и десорбции хроматографируемого вещества, растворЄнного в подвижной фазе.

–аспределительна€ хроматографи€, в основе которой лежит процесс непрерывного перераспределени€ хроматографируемого вещества между подвижной и неподвижной фазами, причЄм это вещество растворимо в каждой из фаз.

»онообменна€ хроматографи€, в основе которой лежит обратима€ хемосорбци€ ионов анализируемого раствора ионогенными группами сорбента. ¬ зависимости от характера ионогенных групп ионообменные сорбенты (иониты) подраздел€ютс€ на катионообменные (катиониты) и анионообменные (аниониты). »онообменна€ хроматографи€ в современном фармакогностическом анализе примен€етс€ весьма ограниченно, главным образом дл€ очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей.

¬ анализе лекарственного растительного сырь€ примен€етс€ несколько методов хроматографического разделени€, подразумевающих соответствующее аппаратурное оформление.

јдсорбционна€ хроматографи€ на колонках используетс€ главным образом дл€ очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей.  лассическа€ хроматографическа€ колонка представл€ет собой стекл€нную трубку, заполненную сорбентом. ƒл€ разделени€ и очистки соедине≠ний растительного происхождени€ чаще всего используют полиамидный сорбент и силикагель, реже примен€ют колоночную хроматографию на сефадексе и алюмини€ оксиде. “ак, очистку суммы флавоноидов травы сушеницы топ€ной и плодов бо€рышника, суммы ксантонов в траве золототыс€чника провод€т с помощью адсорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте. «атем в полученном элюате спектрофотометрическим методом определ€ют содержание действующих веществ.

 ак вариант адсорбционной и/или распределительной колоночной хроматографии дл€ очистки многокомпонентных смесей растительного происхождени€ в последнее врем€ всЄ чаще примен€етс€ метод твЄрдо-фазной экстракции (“‘Ё). “‘Ё отличаетс€ от классической колоночной хроматографии прежде всего принудительной подачей элюента под действием вакуума на выходе из хроматографической системы. ƒл€ получени€ разрежени€ определенной величины используют специальное герметичное устройство-приЄмник (манифолд), в верхней части которого креп€тс€ хроматографические Ђколонкиї (патроны и/или картриджи), а к нижней подключен вакуум-насос с электроприводом. Ќа мировом рынке системы дл€ “‘Ё предлагаютс€ фирмой ЂSupelcoї (—Ўј).

“онкослойна€ хроматографи€, или “—’ (адсорбционна€ хроматографи€ в тонком слое сорбента), чаще всего примен€етс€ при качественном анализе лекарственного растительного сырь€ или на стадии пробоподготовки дл€ очистки анализируемых компонентов (рис. 4).

»спользуют хроматографические пластины с закреплЄнным или незакрепленным слоем сорбента. Ќаиболее распространены сорбенты на основе силикагел€, реже примен€ют алюмини€ оксид, целлюлозу или полиамидный сорбент.  ачественный анализ компонентов лекарственного растительного сырь€ с применением “—’ провод€т путЄм детекции невооруженным глазом флуоресценции или окраски п€тен в ”‘ и видимом свете при сравнении со свидетел€ми. ќсновным параметром при этом, нар€ду с характерным окрашиванием или флуоресценцией п€тен, €вл€етс€ относительное удерживание компонентов, или Rf. »спользование метода “—’ на стадии пробоподготовки в количественном анализе лекарственного растительного сырь€ предусматривает элюирование действующих веществ с хроматографической пластины и последующий анализ элюата другими методами. Ќапример, разделение суммы флавоноидов цветков бо€рышника провод€т на пластинах Ђ—илуфолї или Ђ—орбфилї, после чего п€тно гиперозида элюируют с пластины, а его содержание в элюате определ€ют спектрофотометрическим методом.

–ис. 4. ’роматограмма на пластине гинсенозидов экстракта женьшен€.

 

¬ последнее врем€ активно развиваетс€ метод количественной “—’ с использованием специального прибора Ч денситометра, работа которого основана на измерении плотности флуоресценции или окраски п€тна анализируемого компонента непосредственно на пластине. ƒл€ этого денситометр снабжЄн цифровой видеокамерой или сканером, а обработка полученных результатов производитс€ с помощью специальной программы на компьютере. ѕрименение денситометрии позвол€ет проводить экспресс-анализ компонентов сырь€ без их элюировани€ с пластины. ѕроизводство денситометров активно развиваетс€ как в –оссии, так и за рубежом. Ќа российском рынке в насто€щее врем€ представлена продукци€ отечественного производител€ ЂЋен’ромї, —анкт-ѕетербург (денситометр Ђƒен—канї) и швейцарской фирмы ЂCamagї (спектро-денситометр Ђ—јћAG Scanner 3ї).

»спользование хроматографии на бумаге (Ѕ’), имеющей как распределительный, так и адсорбционный механизмы разделени€ компонентов, в насто€щее врем€ ограничено и примен€етс€ дл€ качественного анализа лекарственного растительного сырь€. ѕо способу перемещени€ подвижной фазы различают восход€щую, нисход€щую и круговую Ѕ’. ƒетекцию осуществл€ют сходным с “—’ образом. “ак, качественный анализ флавонолов листьев вахты трЄхлистной провод€т с помощью восход€щей Ѕ’ с последующим про€влением хроматограммы раствором алюмини€ хлорида.

¬ самом общем виде все перечисленные методы хроматографии не требуют специального аппаратурного оформлени€, за исключением количественной “—’ и твЄрдо-фазной экстракции.   строго приборным методам хроматографического анализа относ€тс€ газова€ и высокоэффективна€ жидкостна€ хроматографи€.

√азова€ хроматографи€ (√’) - это хроматографи€, в которой подвижна€ фаза находитс€ в состо€нии газа или пара. ¬ фармацевтическом анализе наход€т применение газожидкостна€ (√∆’) и газоадсорбционна€ хроматографии. ¬ газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесЄнна€ на твЄрдый носитель, т.е. используетс€ распределительный механизм разделени€ компонентов. ¬ газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой €вл€етс€ твЄрдый адсорбент.

ћетод газовой хроматографии примен€етс€ дл€ анализа летучих веществ (рис. 5), в том числе компонентов эфирных масел, например ледола и палюстрола в эфирном масле побегов багульника болотного.

“акже возможно проведение химической модификации (дериватизации) компонентов анализируемой смеси с целью получени€ летучих производных и их последующий анализ методом √’. ¬ качестве примера газохроматографического анализа с использованием дериватизации можно привести анализ летучих производных карбоновых кислот и моносахаридов, в том числе и растительного происхождени€.

ƒетектирование на выходе из газохроматографической системы производитс€ несколькими способами. Ќаиболее часто примен€ют детекторы теплопроводности (ƒ“ѕ, или катарометр) и пламенно-ионизационный (ѕ»ƒ). –еже используют селективные детекторы, такие как электронно-захватный (Ё«ƒ) и термоионный (“»ƒ).

–ис. 5. ’роматограмма скипидара, полученна€ методом √∆’.

 олонка DB-WAX 30 м „ 0,25 мм, газ-носитель водород, градиент температур 70-200 º— (3 º—/мин), ѕ»ƒ (220 º—):

1 Ц альфа -пинен; 2 Ц камфен; 3 Ц бета -пинен; 4 Ц 3-карен; 5 Ц альфа -фелландрен; 6 Ц альфа -терпинен; 7 Ц лимонен; 8 Ц бета -фелландрен; 9 Ц гамма -терпинен; 10 Ц пара -цимен; 11 Ц терпинолен; 12 Ц кариофиллен; 13 Ц терпинен-4-ол; 14 Ц альфа -терпинеол.

 

Ќа базе колоночной хроматографии возникла высокоэффективна€ жидкостна€ хроматографи€ (¬Ё∆’). ќт классической колоночной хроматографии ¬Ё∆’ отличаетс€ использованием сорбентов с размером частиц 3-10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделени€. ƒл€ обеспечени€ беспреп€тственного прохождени€ элюента через колонку с ультрамелким сорбентом на входе в хроматографическую систему создаетс€ высокое давление. ѕоэтому другим названием ¬Ё∆’ €вл€етс€ Ђжидкостна€ хроматографи€ высокого давлени€ї.

Ћидирующее положение занимает обращЄнно-фазова€ ¬Ё∆’, в которой используютс€ сорбенты на основе силикагел€ с привитыми на его поверхности молекулами непол€рных соединений, таких как высокомолекул€рные углеводороды, фенолы и их производные. ѕри этом хроматографическое разделение происходит за счЄт распределительного (главным образом) и адсорбционного (в меньшей степени) механизмов, детектирование в ¬Ё∆’ осуществл€етс€ с помощью фотометрических и электрохимических методов анализа. ќсновное значение имеет спектрофотометрическа€ детекци€ в ”‘ области.

ѕреимуществом ¬Ё∆’ (особенно обращЄнно-фазовой) перед газовой хроматографией €вл€етс€ возможность исследовани€ практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам. ѕоэтому подавл€ющее большинство действующих веществ лекарственного растительного сырь€ может быть проанализировано этим методом (рис. 6). ¬ фармацевтическом анализе метод ¬Ё∆’ в насто€щее врем€ используетс€ главным образом при анализе препаратов на основе лекарственного растительного сырь€, такого как женьшень, родиола розова€, шиповник и др.

–ис. 6. ’роматограмма смеси фенольных соединений, полученна€ методом ¬Ё∆’.

 олонка Atlantis 4,6 „ 150 мм (5 µм), метанол Ц вода Ц 1 % HCOOH (pH 2,3), градиентный режим; скорость потока 1 мл/мин; температура колонки 30 º—; спектрофотометрическа€ детекци€ (280 нм):

1 Ц кислота галлова€; 2 Ц эпигаллокатехин; 3 Ц катехин; 4 Ц кофеин; 5 Ц эпигаллокатехингаллат; 6 Ц эпикатехин; 7 Ц галлокатехингаллат; 8 Ц эпикатехингаллат; 9 Ц катехингаллат.

 

ƒл€ проведени€ анализа методами √∆’ и ¬Ё∆’ используютс€ аналитические приборы - хроматографы.  оличество отечественных и зарубежных фирм-производителей, выпускающих газовые и жидкостные хроматографы, неуклонно растЄт, поэтому перечислим только некоторые из них. »з отечественных фирм-производителей устойчивую нишу на российском рынке занимают фирма Ђјквилонї, ћосква (жидкостные хроматографы Ђ—тайерї), «јќ ЂЁкоЌоваї, Ќовосибирск (микроколоночный жидкостный хроматограф Ђћилихром ј-02ї) и — ¬ Ђ’роматэкї, …ошкар-ќла (газовые хроматографы Ђ ристаллї). ќгромный спектр продукции дл€ √’ и ¬Ё∆’ выпускаетс€ иностранными фирмами: ЂAgilent technologiesї, ЂHewlett Packardї, ЂWatersї, ЂNeolabї (—Ўј), ЂShimadzuї (япони€-√ермани€), ЂKnauerї (√ермани€).

‘отометрические методы анализа основаны на поглощении электромагнитного излучени€ индивидуальным веществом или группой анализируемых веществ.

Ќаибольшее распространение в применении к фармакогностическому анализу получило электромагнитное излучение ультрафиолетового (”‘) и видимого (¬»ƒ) диапазонов (обычно прин€то считать видимым излучение с длиной волны от 800 до 400 нм, а ультрафиолетовым - от 400 до 200 нм, длина волны меньше 200 нм - далекий ”‘).

¬ зависимости от используемой аппаратуры, различают спектрофотометрический и фотоколориметрический анализ, к последнему близко примыкает колориметрический.

—пектрофотометрический анализ Ч анализ поглощени€ веществом монохроматического излучени€ с определЄнной длиной волны. «десь выполн€етс€ основной закон поглощени€ - закон Ѕугера-Ћамберта-Ѕэра:

где I0 - интенсивность излучени€, падающего на раствор; I - интенсивность излучени€, прошедшего через раствор; c - концентраци€ вещества в растворе; b - толщина сло€, см; D - оптическа€ плотность; k - коэффициент поглощени€ вещества.

Ётот вид анализа выполн€етс€ на спектрофотометрах ¬»ƒ и ”‘ диапазона (обычно 200-1100 нм). –егистрируетс€ спектр поглощени€ (зависимость поглощенного излучени€ от длины волны) или часть спектра поглощени€ (отдельна€ полоса поглощени€). »змерение оптической плотности производитс€ на фиксированной длине волны (как правило, в максимуме полосы поглощени€).

¬ насто€щее врем€ рынок выпускаемых фирмами-производител€ми спектрофотометров ”‘ и ¬»ƒ диапазона очень широк. »з отечественных приборов наиболее распространены спектрофотометры, выпускаемые фирмой ЂЋќћќї (—анкт-ѕетербург) - Ђ—‘-56ї, Ђ—‘-2000/2001ї; фирмой Ђјквилонї (ћосква) - Ђ—‘-101ї, Ђ—‘-103ї, Ђ—‘-201ї. »з зарубежных - спектрофотометры фирмы ЂShimadzuї (япони€) - ЂUVmini-1240ї, ЂUV-1700 PharmaSpecї, ЂUV-2401/2501 PCї, фирмы ЂAnalytic Jenaї (√ермани€) - ЂSpecord-200ї, ЂSpecord-50/40/30ї, ЂSpecol 1100/1200ї и др.

¬се выпускаемые приборы €вл€ютс€ сканирующими, с автоматической записью спектра и управл€ютс€ компьютерами или встроенными процессорами (дл€ компактных моделей). ќни оснащены разнообразными программными продуктами, позвол€ющими оперативно решать различные спектрофотометрические задачи. –азнообразие выпускаемых приборов определ€етс€ цел€ми анализа Ч рутинный поточный анализ или решение сложных аналитических задач.

‘отоколориметрический анализ Ч анализ поглощени€ веществами немонохроматического излучени€, которое получаетс€ с помощью светофильтров, выдел€ющих сравнительно узкий интервал длин волн (20-40 нм).

ѕри фотоколориметрическом анализе закон Ѕугера-Ћамберта-Ѕэра применим с большей или меньшей степенью приближени€ в зависимости от степени посто€нства величины оптической плотности (D) в данном интервале длин волн.

ѕриборы, используемые дл€ такого вида анализа, позвол€ют измерить оптическую плотность лишь в интервале длин, выдел€емых светофильтрами. ƒл€ этих целей используютс€ фотоэлектроколориметры различных типов (например, ‘Ё  или  ‘ ).

 олориметрический анализ основан на сравнении интенсивностей окрасок растворов разных концентраций визуально или при помощи несложных приборов - колориметров.

‘отометрические измерени€ обычно провод€т в водных или спиртовых растворах.

ѕри анализе растительного сырь€ наиболее распространено количественное определение суммы действующих веществ в пересчЄте на конкретное соединение, которое должно отвечать определЄнным требовани€м: это соединение должно входить в состав суммы действующих веществ и дл€ него должен существовать государственный стандартный образец (√—ќ). Ќапример, в траве зверобо€ спектрофотометрически оцениваетс€ содержание суммы флавоноидов в пересчЄте на рутин. ¬ случа€х отсутстви€ √—ќ, в качестве стандарта используют иное соединение, имеющее сходный с определ€емым коэффициент поглощени€ на аналитической длине волны. ѕодобным приЄмом пользуютс€ при фотоколориметрическом определении суммы антраценпроизводных, где в качестве стандарта используют кобальта хлорид (кора крушины, корни ревен€ и др.).

ќпределение концентрации веществ в растворе провод€т трем€ основными способами.

ѕервый способ основываетс€ на измерении оптической плотности с последующим применением закона Ѕугера-Ћамберта-Ѕэра дл€ расчЄта концентрации. Ётот способ применим, когда известен коэффициент поглощени€ исследуемого вещества на данной длине волны. “аким образом определ€ют количественное содержание суммы антоцианов в пересчЄте на цианидин-3,5-дигликозид в цветках василька синего.

¬торой способ Ч определение концентрации исследуемого соединени€ путЄм сравнени€ величин оптических плотностей его раствора и раствора стандартного образца в известной концентрации. “ак определ€ют содержание суммы флавоноидов в пересчЄте на изосалипурпозид в цветках бессмертника песчаного.

“ретий способ Ч построение калибровочного графика с использованием серии растворов стандартного образца известной концентрации, например количественное определение суммы флавоноидов в пересчЄте на ононин в корн€х стальника.

—овременный фармакогностический анализ также предусматривает использование многих других физико-химических методов. ѕри выделении из растений органических веществ, требующих идентификации и определени€ их количественного содержани€, успешно используютс€ такие методы, как пол€риметри€, люминесцентный анализ, » -спектроскопи€, спектроскопи€ €дерного магнитного резонанса, хромато-масс-спектрометри€, электрохимические методы и др.

¬ тех случа€х, когда качество лекарственного сырь€ невозможно удовлетворительно определить химическими или физико-химическими методами, используют биологический анализ. Ётот метод, в частности, €вл€етс€ определ€ющим при анализе лекарственного растительного сырь€, содержащего кардиотонические гликозиды. —ледует отметить, что биологическа€ стандартизаци€ имеет р€д существенных недостатков: трудоЄмкость, высока€ стоимость анализа, мала€ точность.  роме того, биологические методы анализа зачастую не отражают истинного содержани€ действующих веществ в лекарственном растительном сырье.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-01-29; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 1903 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ќеосмысленна€ жизнь не стоит того, чтобы жить. © —ократ
==> читать все изречени€...

295 - | 298 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.031 с.