Ядро клетки выполняет следующие основные функции:
- хранение генетической информации;
- удвоение генетической информации (репликация ДНК) в период, предшествующий клеточному делению;
- реализация генетической программы путем транскрипции и последующей трансляции.
Стандартным ответом клеточного ядра на слабую альтерацию или стимуляцию клетки является активация его специфических функций:
1) транскрипции — синтеза различных видов РНК;
2) репликации — удвоения ДНК и стимуляции митотической активности клетки.
Ядро окружено двухслойной липопротеидной мембраной. Альтерация ядерной мембраны может привести к нарушению:
- пространственной ориентации и фиксации молекул ДНК в ядре;
- передачи электрического сигнала генетическому аппарату клетки;
- избирательного поступления в ядро ионов, гормонов, медиаторов, индукторов и репрессоров, гистонов и кислых ядерных белков;
- выхода из ядра в цитоплазму разных видов РНК, информосом и рибосом.
Грубая альтерация клеточного ядра приводит к мутациям. Мутация — это стойкое изменение структуры ДНК, не запрограммированное в геноме. Представление о том, что мутация есть любое стойкое изменение структуры ДНК, оказывается неверным, поскольку генетический аппарат клетки в онтогенезе не является неизменной структурой. В геноме эукариот присутствует множество мобильных генетических элементов. Это «прыгающие» гены (транспозоны) и мигрирующие нуклеотидные последовательности, которые на разных этапах онтогенеза могут перемещаться и менять свое положение в молекуле ДНК. Однако все эти перестройки не случайны, а запрограммированы в геноме: время и место перемещения различных локусов четко определены генетической программой развития организма. Такая реорганизация молекулы ДНК в онтогенезе служит необходимой предпосылкой полноценного функционирования генома. Патология возникает как при чрезмерной подвижности элементов генома, так и при их избыточной стабильности.
Агенты, вызывающие мутации, называются мутагенами. Различают физические (ионизирующее излучение, УФ-радиация), химические (вещества с большой внутренней энергией связи — модификаторы и аналоги оснований ДНК, сшивающие агенты) и биологические (бактериальные токсины, вирусы) мутагены. Существуют факторы, модифицирующие эффекты классических мутагенов. К ним относятся: комутагены — факторы, потенцирующие действие мутагенов; десмутагены — химические соединения, присутствующие в окружающей среде и способные при взаимодействии с мутагенами уменьшать их активность (капуста, яблоки, лук, зеленый перец содержат вещества, обладающие десмутагенной активностью); антимутагены — вещества, присутствующие в клетке (в организме) и ослабляющие эффект мутагенов (полиненасыщенные жирные кислоты, цистеин, серотонин, глутатион, α-токоферол, пуриновые нуклеозиды, вещества, стабилизирующие рН).
По степени структурных изменений генома различают следующие мутации:
1. Геномные мутации — полиплоидия и анеуплоидия. Полиплоидия — увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному. Полиплоидия в половых клетках приводит к нарушению процесса оплодотворения или ранней гибели плода. Полиплоидия в соматических клетках является проявлением их усиленной функции. Полиплоидные клетки можно обнаружить в регенерирующей ткани, гипертрофированном миокарде и т. п. Анеуплоидия — любое изменение числа хромосом. Это безусловная патология, поскольку нарушается сбалансированность генома.
2. Хромосомные мутации (аномалии): делеция (потеря участка хромосомы), дупликация (удвоение участка хромосомы), инверсия (поворот участка хромосомы на 180°), транслокация (перемещение участка хромосомы). Изменение структуры отдельных хромосом, обнаруживается при световой микроскопии.
3. Генные, или точечные мутации — минимальные, касающиеся отдельных нуклеотидов, изменения в молекуле ДНК, не выявляемые при световой микроскопии. Суть мутационного изменения может заключаться в замене азотистых оснований. Возможны транзиции — замена пурина на пурин (А–Г) и пиримидина на пиримидин (Т–Ц) и трансверсии — замена пурина на пиримидин (А,Г на Т,Ц) или пиримидина на пурин (Т,Ц на А,Г). Это «мягкие» мутации, поскольку их результатом может явиться замена лишь одной аминокислоты в полипептидной цепи. К более глубоким изменениям приводят «жесткие» мутации — точечные выпадения (делеции) или вставки оснований. При этом сдвигается рамка триплетного считывания информации и синтезируется совершенно измененный белок. Возможны мутации, приводящие к возникновению бессмысленных кодонов (нонсенс-мутации). В результате мутаций этого типа обрывается синтез полипептидной цепи в месте образования бессмысленного триплета.
Различные участки молекулы ДНК выполняют в геноме неодинаковые функции, и их мутации имеют различное фенотипическое проявление.
Функционально активные районы (опероны) в молекуле ДНК разделяются спейсерами — участками нетранскрибируемой ДНК. Мутация этих районов ДНК может остаться без последствий (молчащая мутация).
Инициация транскрипции связана с распознаванием молекулой РНК‑полимеразы определенного участка ДНК, называемого промотором. При мутации области промотора нарушается связывание этого фермента с ДНК и не запускается синтез РНК. РНК-полимеразы эукариот сами не способны узнать промотор. Им помогают в этом белковые факторы транскрипции. Перед участком взаимодействия полимеразы с ДНК располагаются короткие нуклеотидные последовательности — «мотивы», узнаваемые факторами транскрипции. Мутация этих участков ведет к выключению образования мРНК.
Транскрипционные факторы типа J — семейство белков, способных образовывать пары из неидентичных субъединиц (гетеродимеры) в результате их фосфорилирования под влиянием протеинкиназ. При этом они приобретают способность взаимодействовать с промоторами разных генов. Интенсивность фосфорилирования транскрипционных факторов возрастает при взаимодействии различных регуляторов (гормонов, факторов роста) с рецепторами клеточной поверхности, образуется большое число разнообразных димеров, запускающих работу целого ряда генов, необходимых для клеточного деления. Если в результате мутации образуется J-фактор с измененными свойствами, это приводит к нарушению регуляции клеточного роста, что может способствовать появлению опухолей. Гены, кодирующие факторы транскрипции или их мембранные рецепторы, могут являться протоонкогенами.
В структуре генетического аппарата про- и эукариот существуют зоны, через которые осуществляется регуляция биосинтеза белка при помощи специфических белков-репрессоров. Репрессорные белки синтезируются под контролем определенных структурных генов и, присоединяясь к определенным участкам ДНК, выключают транскрипцию. Иногда репрессор вырабатывается в форме неактивного предшественника и активируется под влиянием корепрессора. Блок транскрипции может быть снят при взаимодействии белка-репрессора с веществом-индуктором. В роли индукторов могут выступать гормоны, медиаторы, биологически активные вещества, цАМФ и др. Так осуществляется достаточно грубая регуляция биосинтеза белка по принципу «все или ничего». При мутации регуляторных участков может нарушаться фиксация репрессора, что ведет к избыточному, постоянному (конститутивному) синтезу белка. При другом варианте патологии повышается сродство рецепторного участка акцепторной зоны к репрессору и выключается биосинтез белка, поскольку вещества-индукторы не могут снять блок с ДНК.
Более тонкая регуляция биосинтеза белка по принципу «чуть больше – чуть меньше» осуществляется генами-аттенуаторами, присутствующими только в клетках эукариотических организмов. Эти гены подразделяются на энхансеры (усилители) и сайленсеры (ослабители). Гены-аттенуаторы контролируют работу структурных генов, расположенных на той же хромосоме. Для одного структурного гена может быть несколько энхансеров и сайленсеров. Мутация области генов-аттенуаторов приводит к нарушению тонкой регуляции интенсивности белкового синтеза.
Важнейшим элементом генома являются структурные гены, которые определяют первичную структуру белков и пептидов. Функция всех регуляторных элементов генома направлена на оптимизацию работы именно этих генов. Структурный ген эукариот имеет мозаичную природу, т.е. представлен чередованием кодирующих участков — экзонов и молчащих участков — интронов. Мутация экзона приводит к изменению первичной структуры пептида, тогда как мутация интрона может не проявиться фенотипически. Однако при мутации сигнальных (маргинальных) участков интрона (зон перехода интрона в экзон) возможно нарушение процесса созревания мРНК в результате ошибок сплайсинга.
Конечным элементом оперона является ген-терминатор, содержащий бессмысленный триплет. Мутация гена-терминатора, приводящая к «осмыслению» бессмысленного триплета, может приводить к синтезу удлиненной полипептидной цепи с нарушенной функцией.
В результате транскрипции в ядре синтезируется гигантская молекула про-мРНК (дРНК), являющаяся копией всего структурного гена и предшествующих регуляторных участков. Молекула про-мРНК здесь же в ядре подвергается созреванию (сплайсингу). Суть этого процесса заключается в вырезании несмысловых участков (копий регуляторных участков и интронов) и соединении кодирующих последовательностей, считанных с экзонов. Выполняет эту функцию особая категория ферментов — ферменты созревания. В ряде случаев возможен аутосплайсинг, заключающийся в том, что сама про-мРНК, изменяя свою конформацию, вырезает из себя «ненужные» участки. Такие РНК, выполняющие функции эндонуклеаз, получили название «рибозимы».
При ошибках сплайсинга изменяется первичная структура матричной РНК, что ведет к изменению первичной структуры белка. Выявляемый при этом клинически (фенотипически) дефект будет полным аналогом соответствующего генетического нарушения. Следовательно, нарушение процесса созревания мРНК дает новый класс фенокопий.
Наличие сплайсинга как промежуточного этапа между транскрипцией и появлением «зрелой» мРНК заставляет критически отнестись к одной из ключевых догм молекулярной биологии, постулирующей принцип: один ген — один белок (пептид). Оказывается, что из одного и того же первичного транскрипта ферменты созревания и рибозимы в различных клетках и в разных условиях могут вырезать разные районы и, следовательно, один ген в принципе может кодировать несколько белковых молекул.
Образующаяся в результате созревания молекула мРНК в неподготовленном виде не может поступить в цитоплазму. После сплайсинга в ядре идет процесс посттранскрипционной модификации мРНК. Он заключается в том, что с одного конца к молекуле мРНК прикрепляется метилгуанозин, обеспечивающий поступление мРНК на рибосому. С другого конца присоединяется фрагмент поли‑А (около 200 адениловых нуклеотидов), который стабилизирует мРНК, препятствуя ее разрушению нуклеазами. Все внутриядерные преобразования про-мРНК претерпевает будучи связанной с особыми белковыми частицами — информоферами. Последние участвуют и во внутриядерном транспорте мРНК. При переносе зрелой мРНК из ядра в цитоплазму информоферы остаются в ядре, а мРНК соединяется с цитоплазматическими белками, в результате чего образуются новые частицы — информосомы, представляющие собой форму транспорта мРНК на рибосомы.
Патология может касаться любого этапа формирования зрелой мРНК и ее транспортировки на рибосому. Результатом изменения этих процессов будет нарушение биосинтеза белка в клетке.
Мутации могут происходить как в соматических, так и в половых клетках. Мутация соматических клеток может привести к активации механизмов канцерогенеза, стимуляции процессов клеточного старения, изменению антигенной структуры клетки, прекращению синтеза или синтезу измененного клеточного белка, а также к гибели клетки вследствие выключения ключевого фермента метаболизма или активации механизмов апоптоза. Мутация половых клеток приводит к развитию наследственного заболевания или наследственного предрасположения. В основе наследственного заболевания лежит генетический дефект, проявляющийся в обычных (в любых) условиях среды. В основе наследственного предрасположения лежит генетический дефект, для проявления которого необходимы определенные условия (гипоксия, вирусная или бактериальная инфекция, действие лекарственных препаратов и т.п.).
В процессе эволюции сформировались мощные механизмы защиты генетического аппарата и повышения надежности путей реализации генетической программы. К механизмам защиты генома относятся: работа ДНК-репарирующих ферментов, исправляющих ошибки в молекуле ДНК, функция продуктов ряда антионкогенов, например белка р53, контролирующего целостность генома, амплификация генов — многократное дублирование некоторых локусов ДНК, полиплоидия соматических клеток, действие антимутагенов, а также способность гистонов «гасить» излишек энергии, получаемой молекулой ДНК в ходе фотохимических реакций. Недостаточность любого механизма защиты, возникающая под влиянием различных патогенных факторов, способствует нарушению структуры и функции генетического аппарата клетки.
Особую роль в патологии, в частности, при взаимодействии клетки с онкогенными вирусами, играет присутствующий в ядре фермент обратная транскриптаза, осуществляющая синтез ДНК на матрице РНК.
В генетическом аппарате клетки запрограммировано определенное число делений, которые может претерпевать дифференцированная соматическая клетка (ограничение Хейфлика). Данное ограничение обеспечивается работой особого счетчика митозов, фиксирующего укорочение теломерных районов хромосом в результате их недорепликации при каждом клеточном делении. При достижении критического уровня укорочения, который генетически детерминирован, запускается процесс апоптоза. Вместе с тем, во всех ядросодержащих клетках организма имеется фермент теломераза, способный достраивать укороченные теломерные районы и тем самым выключать счетчик митозов. В дифференцированных клетках этот фермент неактивен, однако, он работает в стволовых и раковых клетках, обеспечивая их потенциальное бессмертие. Работа данного фермента в стволовых клетках тонко регулируется. Избыточная активация теломеразы в соматических клетках и нарушение регуляции ее активности являются существенным моментом в малигнизации клетки. Кроме того, активность теломеразы может регулировать темп клеточного старения.
Важным контролирующим механизмом, участвующим в поддержании гомеостаза в клеточной популяции, служит апоптоз — генетически детерминированная (запрограммированная) гибель клетки. В литературе обычно противопоставляются два механизма клеточной смерти: некроз (случайная, «насильственная» смерть) и апоптоз (естественная, управляемая гибель клетки). Однако «некроз» есть понятие не клеточного, а тканевого уровня. При некрозе гибель клетки сопровождается выраженной сосудисто-тканевой реакцией, освобождением большого количества внутриклеточных ферментов, ионов, активацией или новообразованием биологически активных веществ, которые участвуют в формировании воспалительной реакции, вторичной альтерации здоровых клеток и увеличении площади очага повреждения. Этот механизм насильственной клеточной гибели, который противопоставляется апоптозу, более логично обозначать как «цитолиз», поскольку этот термин отражает суть явления и фиксирует внимание лишь на изменениях, происходящих с клеткой, — а цитолиз и апоптоз — клеточные события. Апоптоз не сопровождается развитием воспалительной реакции: разрушенные клеточные структуры определенным образом организуются и подвергаются фагоцитозу.
Для реализации апоптотической гибели клетки эволюционно сформировались сложные, тонко организованные и точно регулируемые внутриклеточные механизмы, позволяющие в ответ на внешние или внутренние сигналы, «выбраковывающие» определенную клетку в многоклеточной популяции, запустить каскад процессов, ведущих к ее самоуничтожению.
Апоптоз — многоэтапный процесс. Он может запускаться внешним сигналом, который воспринимается рецепторами цитоплазматической мембраны: Fas‑рецептором (CD-95, APO-1) или рецептором фактора некроза опухоли (ФНО). Fas-белок экспрессируется на клетках тимуса, печени, почек и сердца. Fas-лиганд (FasL) экспрессируется Т-киллерами и NK-клетками. Fas-зависимый апоптоз регулирует гомеостаз в системе Т- и В-лимфоцитов. Некоторые опухолевые клетки способны экспрессировать FasL и атаковать Т-киллеры и NK-клетки, вызывая их апоптоз.
Другим внешним сигналом, запускающим апоптоз, является воздействие на клетку-мишень белка перфорина, вырабатываемого Т-киллерами. Под влиянием перфорина в мембране клетки образуются каналы, по которым поступают ферменты, выделяемые Т-киллером, в частности гранзим В — специфическая протеаза, активирующая ключевой фермент апоптоза — каспазу-3.
При определенных условиях в клетке формируется эндогенный сигнал запуска апоптоза. Его источником могут служить внутриклеточные органоиды. Так, из митохондрий при их набухании и повышении проницаемости наружной мембраны освобождаются цитохром С, прокаспаза-2, -3, -9, белки AIF и SMAC, которые инициируют процесс апоптоза. При избыточном накоплении ионов кальция в пузырьках СПР активируется прокаспаза-12, которая активирует каспазу-3 и запускает программу гибели клетки. Показана связь между ЭПР-зависимым апоптозом и разрушением нейронов мозга при болезни Альцгеймера. Сигналом для инициации апоптоза является нарушение баланса между продуктами клеточных протоонкогенов и антионкогенов, свидетельствующее о повреждении клеточного генома. Антионкогенный продукт — белок р53 контролирует движение клетки в клеточном цикле, работу ДНК-репарирующих ферментов и апоптоз. При появлении нерепарируемого генетического дефекта клетка выключается из митоза и направляется в апоптоз, чем обеспечивается поддержание целостности генома в клеточной популяции.
Многочисленные начальные сигнальные механизмы ведут в конечном итоге к активации ферментов — каспаз, ответственных за основные этапы апоптоза. Известны 14 ферментов семейства каспаз. Различают инициаторные и эффекторные каспазы (соответственно, каспазы 1-го и 2-го эшелона). К каспазам 1‑го эшелона относятся каспазы-2, -8, -9, -10, -12; к каспазам 2-го эшелона — каспазы-3, -6, -7. Каспазы 1-го эшелона активируют каспазы 2-го эшелона. Субстратами эффекторных каспаз являются более 60 различных белков. В результате действия эффекторных каспаз:
1) подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, и активирующийся фермент вызывает межнуклеосомные разрывы хроматина с образованием фрагментов ДНК размером 180–200 пар нуклеотидов;
2) инактивируются ферменты, участвующие в репарации ДНК, сплайсинге мРНК и репликации;
3) разрушаются белки цитоскелета;
4) модифицируются белки-регуляторы клеточного деления;
5) разрушаются антиапоптозные белки семейства Bcl-2;
6) модифицируются белки, участвующие в межклеточной сигнализации, и ядерные факторы транскрипции.
Процесс апоптоза находится под антагонистическим контролем многих внутриклеточных факторов: имеются антиапоптозные белки семейства Bcl-2, IAP и проапоптозные белки семейства Bax.
В роли внешних модификаторов апоптоза могут выступать оксид азота и супероксид, каждый из которых обладает проапоптотическим эффектом, который однако может сменяться на цитопротекторный при их взаимодействии. Физиологическими активаторами апоптоза являются ФНОa, дефицит ростовых факторов, ионы Са, глюкокортикоиды. В качестве индукторов апоптоза при клеточном повреждении могут выступать белки теплового шока, вирусы, оксиданты, свободные радикалы, продукты ПОЛ, бактериальные токсины, ультрафиолетовое и рентгеновское излучение. Ингибиторами апоптоза являются ростовые факторы, экстраклеточный матрикс, нейтральные аминокислоты, ионы цинка, эстрогены, андрогены, ИЛ-9, ряд цитокинов.
Патология апоптоза может приводить к нарушению:
1) запрограммированного удаления клеток в процессе эмбриогенеза;
2) гормонозависимой инволюции клеток у взрослого организма, например отторжения клеток эндометрия в процессе менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках во время менопаузы и т. п.;
3) элиминации клеток в быстро пролиферирующих клеточных популяциях (например, эпителия крипт тонкой кишки);
4) противоопухолевого иммунитета;
5) формирования иммунологической толерантности, основанной на селекции и уничтожении аутореактивных клонов Т-лимфоцитов, и развитию аутоиммунных заболеваний;
6) реакции тимико-лимфатического аппарата на действие глюкокортикоидов;
7) реализации реакций клеточного иммунитета и ГЗТ;
8) элиминации клеток, пораженных вирусами;
9) репарации мутационных изменений в геноме клетки.
Равновесие между клеточным обновлением и апоптозом обеспечивает баланс в клеточной популяции и нарушение этого равновесия ведет к гиперпластическим процессам или атрофии тканей.
Важное место в обеспечении клеточного гомеостаза занимают механизмы подавления репродукции в клетке чужеродного генома. Эту функцию выполняет семейство полифункциональных гликопротеидов — интерферонов (ИФН). На основании антигенных различий у человека выделяют три класса ИФН: a, b и g. ИФНa продуцируется лейкоцитами при вирусных инфекциях. ИФНb образуется фибробластами и дифференцированными клетками соединительной ткани. ИФНg синтезируется Т-лимфоцитами в ходе иммунного ответа. Гены, ответственные за синтез ИФН, локализованы во 2-й и 9-й хромосомах. Пятая хромосома содержит регуляторные гены системы ИФН. Индукцию синтеза ИФН вызывают самые разнообразные факторы: вирусы, бактерии, риккетсии, простейшие, экзо- и эндотоксины, искусственные РНК-полинуклеотиды, полифосфаты, полисульфаты. Действие ИФН направлено на подавление различных этапов внутриклеточной репродукции вирусов. Кроме того, ИФН могут ингибировать рост опухолей за счет торможения пролиферации, цитолиза раковых клеток, активации натуральных киллеров и макрофагов, иммуномодуляции и гормоноподобных эффектов. Синтезированный в клетке ИФН освобождается в среду и вовлекает в ответ соседние клетки, на мембране которых имеются соответствующие рецепторы.
В условиях патологии возможно нарушение синтеза ИФН в результате мутационных изменений в структурных генах или в регуляторных участках. Для проявления эффектов ИФН необходим полноценный метаболизм клетки и прежде всего синтез белка и нуклеиновых кислот, поскольку сами ИФН являются лишь сигнальными молекулами, запускающими каскад реакций, осуществляемых при участии клеточного генома.
При повреждении генетического аппарата, внутриклеточных структур или частичной денатурации клеточных белков включаются аварийные механизмы репарации, включающие выработку группы шаперонных белков, важнейшими представителями которых являются белки теплового шока (БТШ). Экспрессия данной группы белков возрастает при различных клеточных повреждениях (воспаление, инфекция, гипоксия, оксидативный стресс и т. п.). Шаперонные белки способны обеспечивать работу репаразной системы, восстанавливать измененную конформацию белковых молекул, а также исправлять поломки внутриклеточных органоидов. При мутации генов, кодирующих БТШ, или нарушении трансляции и посттрансляционных событий уменьшается цитопротекторное действие шаперонов, снижается порог апоптоза и цитолиза.
