Для постановки лабораторного диагноза проводят микробиологическое исследование. Материалом для исследования служат испражнения. При сборе испражнений нужно учитывать, что микробы находятся, главнымобразом, в слизи и в гное. Испражнения исследуют с первых дней болезни, до начала антибактериальной терапии. Фекалии собирают в дезинфицированный смытый горшок илиподкладное судно, забирают 3–5 гр фекалий из верхней части прямой и из сигмовидной кишок, помещают в консервант. При исследовании на дизентерию не следует собирать последние жидкие порции испражнений, особенно после дачи слабительного, так как они могут быть содержимым тонкого кишечника.
Сбор испражнений можно производить, не дожидаясь акта дефекаций, а вводить в прямую кишку ватные тампоны, ректальные петли (двойные алюминиевые петли, вмонтированные в ручку) или ректальные трубки (трубки Цимана). Ректальные трубки представляютсобой стеклянные трубки диаметром от5мм (для детей) до 15 мм (для взрослых), длинойоколо 150 мм, нижний конец запаян и оплавлен, на расстоянии 15–20 см от запаянного конца имеется два оплавленных отверстия, расположенных на противоположных стенках, одно ниже другого. Открытый конец закрыт ваткой, трубки опускают через ватную пробку в пробирку и в таком виде стерилизуют. Трубку вводят в прямую кишку, она прилегает к стенкам слизистой и при вытягивании материал через отверстия скапливается внутри трубки.
Исследование секционного материала нужно проводить как можно быстрее после смерти. Исследуют кишечник, мезентериальные железы, кусочки печени, селезенки. Материал доставляют в стерильной посуде – баночках, широких пробирках.
Основным методом исследования при дизентерии является бактериологический.
Бактериологический метод применяют для выделения возбудителя и его идентификации. Наибольшее количество положительных результатов получают при посеве материала у постели больного, но такой посев не всегда можно сделать, поэтому для предупреждения гибели возбудителей материал помещают в консервант – глицериновую смесь или фосфатный буфер.
I этап
В первый день исследования производят посев материала на cpeдy Плоскирева, эозинметиленовую среду (среда Левина) и другие. Так как каждая среда обладает каким-нибудь недостатком, рекомендуется использование двух сред. Особое место занимают среды с добавлением желчных солей, они высокоэффективны и создают тем самым весьма благоприятные условия для выявления дизентерийных бактерий.
Для посева выбирают слизисто-гнойные комочки большой стерильной петлей, промывают их дважды в стерильном изотоническом растворе и переносят на поверхность среды вчашки Петри. Затем берут стерильный шпатель и досуха растирают материал в этой чашке, потом, не прожигая шпателя, производят посев во второй и третьей чашке. Можно делать высев и на 1 чашке по секторам. Засеянные чашки помещают в термостат на 18–20 часа при 37°С.
II этап
На второй день чашки просматривают невооруженным глазом и при помощи лупы. На дифференциально-диагностических средах шигеллыобразуют бесцветные прозрачные круглые, слегка выпуклые блестящие колонии. Палочки Зонне могут давать плоские распластанные с неровным краем колонии, мутные, но сохраняющие прозрачность.
Подозрительные колонии отсевают на комбинированную среду Олькеницкого и помещают в термостат на сутки. Эта среда позволяет определить у наследуемых культур ферментацию углеводов, мочевины, образование сероводорода. Среду готовят таким образом, чтобы была и скошенная поверхность и столбик высотой 3–4 см. Исследуемую культуру засевают штрихом по скошенной поверхности, а также уколом в глубинустолбика. Так как в среде содержится небольшое количестве глюкозы (ферментация её идет в анаэробных условиях), среда Олькеницкого изменит цвет в столбике, а сбраживание лактозы и сахарозы идет в аэробных условиях, среда изменит цвет и в скошенной поверхности, и в столбике. При разложении мочевины рН среды становится резко щелочной – вся среда станет оранжевой. При образовании сероводорода наблюдается почернение среды. Для быстрой идентификации шигелл рекомендуется следующий метод: подозрительную колонию (лактозонегативная на среде Эндо) пересевают на среду TSI (англ. triple sugar iron) – трехсахарный агар (глюкоза, лактоза, сахароза) с железом для определения продукции сероводорода; или на среду, содержащую глюкозу, лактозу, сахарозу, железо и мочевину.
Любой организм, который расщепляет мочевину через 4–6 ч инкубирования, вероятнее всего, относится к роду Proteus и может быть исключен.
Микроорганизм, образующий сероводород или имеющий уреазу, или образующий кислоту на косячке (ферментирует лактозу или сахарозу), может быть исключен, хотя штаммы, образующие сероводород, должны быть исследованы как возможные члены рода Salmonella.
Во всех других случаях культура, выросшая на этих средах, должна быть исследована и, если ферментирует глюкозу (изменение цвета столбика), выделена в чистом виде. Одновременно она может быть исследована в реакции агглютинации на стекле с соответствующими антисыворотками к роду Shigella. При необходимости проводят другие биохимические тесты, проверяющие принадлежность к роду Shigella, а также изучают подвижность.
III этап
После суточного инкубирования для дальнейшего исследования отбирают культуры, ферментирующие глюкозу, т.е. те пробирки с культурой, в которых среда Олькеницкого изменила цвет в столбике. У культур, подозрительных по своим ферментативным и культуральным свойствам на шигеллы, изучают антигенную структуру для определения вида. Если таких культур нет, выдают отрицательный ответ.
Вид, серовар, подсеровар выделенной культуры устанавливают при помощи адсорбированных шигеллезных сывороток. Анализ антигенной структуры начинают с реакций агглютинации на стекле со смесью №1. В смесь №1 входят шигеллы, не ферментирующие маннит. Это S. dysenteriae 1 и 2 (поливалентные и моновалентные), S. dysenteriae 3–7 (поливалентные и моновалентные), S. dysenteriae 8-12 (поливалентные и моновалентные). Смесь № 2 включает сыворотки к шигеллам, ферментирующим маннит: к типовым антигенам S. flexneri I, II, III, IV, V, VI, к групповым антигенам S. flexneri 3, 4, 6,7,8 – поливалентная, к антигенам S. boydii 1–18 (поливалентная и моновалентные), к антигенам S. sonnei I фазы, II фазы, к антигенам S. flexneri I–VI + S. sonnei – поливалентная.
При положительной реакции со смесью выделенную культуру агглютинируют с каждой сывороткой, входящей в смесь. Если реакция положительна с сывороткой к шигеллам Зонне иНьюкасл, выдают ответ. Если культура агглютинируется поливалентной сывороткой к шигеллам Флекснера, изучение антигенной структуры выделенной культуры продолжают с типовыми групповыми сыворотками к шигеллам Флекснера, и при положительной реакции с одной изгрупповых и типовых сывороток определяют по таблице серовар иподсеровар шигеллы.
Идентификация выделенных культурне представляет затруднений, если их биологические и серологические свойства совпадают с характеристикой одного из видов шигелл. Если же есть отклонения от типичной характеристики, то проводят дополнительные исследования, позволяющие с уверенностью подтвердить или исключить принадлежность выделенной культуры к шигеллам. В первую очередь изучают ферментативную активность на "пестром ряду", способность расщеплять аминокислоты. С целью подтверждения принадлежности культуры к шигеллам определяют способность культуры лизироваться поливалентным дизентерийным фагом.
По проведенному исследованию выдают ответ.
В качестве ускоренного катода диагностики дизентерии применяют люминесцентную микроскопию исследуемого материала.
Серологический метод лабораторной диагностики дизентерии основан на обнаружении антител к шигеллам в сыворотке крови больных дизентерией. Антитела появляются на 5–8 день болезни. Максимальное накопление их происходит на 2–3неделе.
Серологический диагноз позволяет ретроспективно обосновать диагноз при стертых формах заболевания, а также выявить вид возбудителя дизентерии. В сыворотке крови больных определяют титр агглютининов в реакции агглютинации с дизентерийным диагностикумом, содержащим взвесь дизентерийных микробов, убитых формалином. Диагностический тигр агглютининов 1:200, у детей, в связи с пониженной реактивностью, диагностический титр 1:100, а у детей до 3 лет – 1:50. Кроме реакцииагглютинации, антитела в сыворотке больных определяют в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным диагностикумом. По результатам реакции выдается ответ, в котором отмечают положительный или отрицательный результат с каждым примененным антигеном, при положительной реакции указывается титр.
Серологическое исследование при дизентерии, вызванной палочками Ньюкасл, Бойда практически значения не имеет.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
1. Современную классификацию бактерий семейства Enterobacteriaceae, род шигелла
2. Характеристику биологических свойств бактерий рода шигелл
3. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивостьherichia и иммунитет при шигеллезе
4. Основные клинические проявления заболевания при шигеллезе
6. Методы лабораторной диагностики шигеллеза
7. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей бактериальной дизентерии по биохимическим и антигенным свойствам
2. Интепретировать результаты бактериологического исследования микрофлоры кишечника
3. Классифицировать бактериальные препараты в соответствии с их назначением (при дизентерии и дисбиозах)
