Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ћетод иммуноблота

ћетод иммуноблоттинга (первоначальное название Western blot, WB1) был разработан главным образом в цел€х обнаружени€ в сыворотках пациентов антител, реагирующих с отдельными белками возбудителей инфекционных заболеваний, чаще всего вирусов.

ћетод представл€ет собой следующее.

 

1. ¬ культурах клеток in vitro (в насто€щее врем€, как правило, в промышленных масштабах) выращивают препаративные количества реплицирующихс€ вирусов.

2.  летки разрушают (ультразвуком или иначе), вирусную массу выдел€ют из культуральной смеси методами ультрацентрифугировани€.

3. ¬ирусные частицы диссоциируют на отдельные белки детергентами и подвергают электрофорезу в геле. ¬ результате каждый вирусный белок в соответствии со своей молекул€рной массой и электрическим зар€дом занимает определенную позицию в геле. Ѕез применени€ красок и специальных про€вл€ющих реагентов фракционированные электрофорезом белки в геле не видимы глазу.

1 ¬первые блест€ща€ методическа€ иде€ Ђблоттингаї (переноса на Ђпромокашкуї; blot по-английски - п€тно на промокашке) пришла в голову и была реализована применительно к электрофоретическому анализу ƒЌ  биохимиком E.M. Southern в 1975 г. »з уважени€ к автору коллеги-биохимики воспользовались лингвистической особенностью фамилии Southern (южный) и тот же метод, примененный к –Ќ , назвали Northern blot (северный), а к белкам - Western blot (западный).

4. ¬ цел€х существенной экономии дорогосто€щих реагентов в дальнейшем фракционированные белки из гел€ Ђпромокаютї, перенос€ таким образом на плоский пористый материал - нитроцеллюлозу. ¬ производственных масштабах перенос продуктов электрофоретического разделени€ в геле на нитроцеллюлозу осуществл€ют также электрофорезом.

5. Ћист нитроцеллюлозы с перенесенными на нее электрофоретически разделенными белками вируса нарезают на тонкие полоскистрипы (strip), соответствующие по формату специальным выпускаемым промышленностью пластмассовым Ђкорытцамї, в которых стрипы обрабатывают испытуемыми сыворотками и про€вл€ющими реагентами.

 

6. —трип заливают испытуемой неразведенной и разведенной 1:10 (или подбирают иные разведени€) сывороткой, инкубируют 1 ч или более, тщательно промывают фосфатным солевым буфером с детергентом (0,1% Tween-20), заливают раствором конъюгата антииммуноглобулиновых антител с ферментом (например, пероксидазой хрена), инкубируют 1 ч, тщательно промывают, внос€т раствор субстрата (например, ортофенилендиамина с перекисью водорода), после чего наблюдают, не про€в€тс€ ли окрашенные полосы в зонах расположени€ фракционированных вирусных белков.

¬ случае, если у человека в крови нет противовирусных антител, стрип остаетс€ неокрашенным (имеет место лишь неспецифический легкий фон по всей площади стрипа). Ёто отрицательный результат. ≈сли окрашенными оказываютс€ все полосы вирусных белков, результат квалифицируют как положительный. ≈сли окрашиваютс€ не все, а 1-2 полосы, результат рассматривают как неопределенный.

Ћожноотрицательные результаты в иммуноблоте крайне маловеро€тны. ѕоэтому по международным соглашени€м сертифицированные дл€ клинической диагностики промышленно выпускаемые иммуноблоттинговые тест-системы прин€ты в качестве подтверждающих по отношению к планшетным и прочим скрининговым иммуноанализам. Ќа рис. 4.11. представлена схема Ђсэндвичаї, приготовленного дл€ блоттинга.

–ис. 4.11. —хема Ђсэндвичаї, приготовленного дл€ блоттинга



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
“вердофазный непр€мой иммуноферментный анализ | „увствительность иммуноанализов
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 362 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

—вобода ничего не стоит, если она не включает в себ€ свободу ошибатьс€. © ћахатма √анди
==> читать все изречени€...

333 - | 305 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.009 с.