Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ќпределение уровн€ Igћ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии

1. √отов€т 1,25-1,5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 ћ веронал-мединаловом буфере с рЌ 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Ќавеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на вод€ной бане при 56 ∞— до полного растворени€ полимера.

2. ¬ раствор агара добавл€ют рассчитанное количество (расчет производ€т, исход€ из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки,

быстро и тщательно перемешивают.  аждый вариант антиизотипической антисыворотки добавл€ют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы).

3. –аствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стекл€нные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик дл€ ровного затвердевани€ агара/агарозы в гель. √ель прозрачен и бесцветен. Ќа стандартное предметное стекло дл€ микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуетс€ примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой.

 

4. ¬ геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) р€да лунок. –ассто€ни€ между центрами лунок - пор€дка 1,5 см.

5. «аранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентраци€х.

6. ¬ три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки.

7. —текла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 ∞— 24-48 ч. «а это врем€ происходит спонтанна€ диффузи€ белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимис€ в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимис€ в агаровом геле. ѕоскольку диффузи€ свободно идет во всех направлени€х, преципитаты имеют форму правильных колец. ѕреципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измер€ют в миллиметрах.

8. ƒл€ снижени€ фона образовани€ неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор мен€ют несколько раз.

9. ≈сли задачи работы требуют долгосрочного хранени€ препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и крас€т анилиновыми красител€ми, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красител€ - 50 мл лед€ной уксусной кислоты и 150 мл воды).

ќкрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают.

¬нешний вид стекол с результатами –»ƒ и калибровочна€ крива€ показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).

 

–ис. 4.2. ¬нешний вид стекол с результатами –»ƒ и калибровочна€ крива€



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
–адиальна€ иммунодиффузи€ по ћанчини | »ммуноэлектрофорез
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 329 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ќе будет большим злом, если студент впадет в заблуждение; если же ошибаютс€ великие умы, мир дорого оплачивает их ошибки. © Ќикола “есла
==> читать все изречени€...

660 - | 526 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.011 с.