Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


Ћабораторна€ работа 3-2

 ћ  -562 мет€т изотопом 3Ќ-уридином (1 мк и/мл) и инкубируют 1 ч при 37 ∞—. «атем клетки трижды отмывают культуральной средой, содержащей 10% —Ё . ќтмытые  ћ выдерживают в культуральной среде 2 ч при 37 ∞— и отмывают еще раз с целью удалени€ 3Ќ-уридина, не включившегос€ в –Ќ   ћ. √отов€т рабочую суспензию меченых  ћ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 1×106  ћ и 5 мкг панкреатической –Ќ -азы.

÷итотоксическую реакцию провод€т в круглодонных 96-луночных микропланшетах. ¬ каждую €чейку помещают по 100 мкл рабочей суспензии меченых  ћ с –Ќ -азой и 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток (рабоча€ концентраци€ - 1х107/мл). »спользуют различные соотношени€  Ё: ћ - 100:1; 50:1; 25:1; 12,5:1.  летки каждого разведени€ помещают как минимум в 3 лунки. ¬ контрольных пробах меченые  ћ инкубируют без мононуклеарных клеток.

 ультуры инкубируют 14 ч при 37 ∞— и с 5% содержанием —ќ2. ѕосле инкубации содержимое лунок перенос€т на фильтры с помощью собирател€ клеток - харвестра. ‘ильтры высушивают, помещают в сцинтилл€ционную жидкость, провод€т учет реакции с помощью β-счетчика. ѕоказатель функциональной активности естественных киллеров выражают в виде индекса цитотоксичности (»÷), который определ€ют по формуле:

ќценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии

¬ качестве метки дл€  ћ примен€ют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир ( ‘ƒЁ), который образует прочную ковалентную св€зь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не вли€ет на жизнеспособность клетки.

 

ѕервоначально нефлуоресцирующий  ‘ƒЁ проникает через клеточную мембрану.  арбоксифлуоресцеины св€зываютс€ с внутриклеточными молекулами, формиру€ конъюгаты, обеспечива€ стойкое флуоресцентное окрашивание клетки. ќкрашенные таким образом  ћ  -562 смешивают с  Ё и инкубируют в течение нескольких часов. ѕосле окончани€ культивировани€ клетки окрашивают пропидий йодидом дл€ определени€ убитых в ходе реакции  ћ. ѕо количеству убитых  -562 определ€ют активность NK-клеток. јнализ провод€т на проточном цитофлуориметре и определ€ют количество  ћ, включивших  ‘ƒЁ (зеленое свечение), и количество убитых клеток, включивших пропидий йодид (красное свечение).



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
—в€зывание с тетрамерными структурами MHC класса I |  омплементзависима€ цитотоксичность
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 352 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

80% успеха - это по€витьс€ в нужном месте в нужное врем€. © ¬уди јллен
==> читать все изречени€...

303 - | 318 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.011 с.