Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ќценка пролиферативной активности лимфоцитов

Ћимфоциты - единственный тип клеток крови, дл€ которых пролифераци€ в периферических ткан€х €вл€етс€ физиологической нормой и об€зательным этапом в развитии иммунного ответа. ѕоэтому количественна€ оценка пролиферативной активности лимфоцитов в спланированных экспериментальных услови€х может служить мерой реактивности лимфоцитов на тот или иной внешний стимул. ≈сли такой внешний стимул - специфический антиген, то уровень пролиферативного ответа лимфоцитов допустимо расценить как показатель иммуногенности препарата, содержащего антиген (способности вызывать на себ€ иммунный ответ), или численности клона(ов), реагирующих на данный антиген лимфоцитов.

—уществуют вещества, которые называют митогенами за их способность вызывать деление клеток. ћитогены обусловливают поликлональную или олигоклональную пролиферацию лимфоцитов. ѕервым случайно обнаруженным в процессе рутинных работ в банке крови по гемагглютинации эритроцитов митогеном лимфоцитов стал лектин фитогемагглютинин (‘√ј) из обыкновенной фасоли Phaseolus vulgaris, способный агглютинировать эритроциты только определенного серологического типа. ‘√ј - сильный митоген, индуцирующий переход клеток из стадии G2 в митоз. ¬первые ‘√ј выделен из фасоли ѕ. Ќовеллом в 1960 г. — тех пор по€вилс€ новый метод оценки пролиферативной активности лимфоцитов человека и экспериментальных животных, получивший название бласттрансформаци€. ќказалось, ‘√ј вызывает митотическое деление преимущественно “-лимфоцитов. “акже преимущественное митогенное действие в отношении “-лимфоцитов оказывает лектин конканавалин ј, выделенный из растений семейства бобовых

Canavalia ensiforme. ¬ последнее врем€ получили широкое распространение моноклональные антитела (монј“) против CD3 или CD28 антигенов (как наиболее мощные поликлональные стимул€торы “-лимфоцитов).

ћитоген (pokeweed mitogen) из корн€ растени€ лаконоса Phytolacca americana стимулирует пролиферацию и ¬- и “-лимфоцитов, а кроме того вызывает поликлональную продукцию иммуноглобулинов ¬-лимфоцитами. ѕролиферацию преимущественно ¬-лимфоцитов вызывают препараты липополисахаридов (Ћѕ—) эндотоксинов из грамотрицательных бактерий.

ћетоды оценки пролиферативной активности лимфоцитов в культуре in vitro рассчитаны на вы€вление и измерение уникального дл€ клеточного делени€ процесса - удвоени€ ƒЌ  в S-фазе митоза.

ћетодов существует несколько.

1. »сторически первый метод - микроскопический (морфологический).  летки, прошедшие S-фазу, но еще не прошедшие митоз, имеют двойное количество ƒЌ  и остальных компонентов хромосом. —оответственно вс€ клетка больше по размеру, чем недел€щиес€ клетки, что хорошо видно на препаратах мазков или даже в живой культуре под световым микроскопом. ћикроскопический метод детекции клеток в S-фазе называют Ђреакцией бласттрансформацииї и в насто€щее врем€ используют по крайней мере дл€ демонстрации бластных и других форм лимфоцитов. ѕомимо поликлональной активации “- и ¬-лимфоцитов, достаточно широко используютс€ методы, основанные на стимул€ции антиген/аллерген- специфических клонов “- и ¬-клеток. ≈стественно, что в последнем случае число трансформированных клеток может быть мало. ƒл€ их подсчета морфологический метод не пригоден.

¬ лабораторной генетике реакцию бласттрансформации лимфоцитов примен€ют с целью визуализации хромосом и анализа кариотипа человека. ƒл€ остановки клеточного цикла на стадии митоза используют колхицин.

2.  олорометрический метод. ќн основан на использовании внутриклеточных прижизненных красителей, включаемых в цепи ƒЌ . Ёто, например, MTT - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид.

 

3. ћикроцитофлуорометрический метод (FACS). ќн основан на использовании флюоресцентных красителей, включаемых в цепи ƒЌ , с оценкой на проточном цитометре.

4. –адиоизотопный метод. ќн основан на использовании меченых нуклеотидов, включаемых в состав только ƒЌ , в частности тимидина (3H-Td) - β-излучатель, уридина 14C-Td - γ-излучатель или 131I-дезоксиуридина - γ-излучатель.

Ђ«олотым стандартомї дл€ оценки пролиферации €вл€етс€ последний метод - радиоизотопный, поскольку с его помощью подсчитывают не только клетки, наход€щиес€ в данный момент в S-фазе, но и уже поделившиес€ дочерние клетки, которые другие названные методы уже Ђне вид€тї. ќпишем кратко метод оценки пролиферации по включению 3Ќ-тимидина.

A. —оздают экспериментальную систему стимул€ции лимфоцитов in vitro: это может быть внесение антигена, митогена или других стимулирующих агентов (цитокины, антитела против поверхностных антигенов и др.). ¬рем€ культивировани€ лимфоцитов зависит от стимул€тора: дл€ митогенов - обычно 72 ч, дл€ антигена - до 6- 7 сут.

Ѕ. «а 4-24 ч до остановки эксперимента in vitro ввод€т меченый тимидин. „аще всего используют метил-3Ќ-тимидин. ”дельна€ радиоактивность препарата - около 1-2  ю/мкмоль. ≈сли удельна€ активность коммерческого препарата выше, то его развод€т Ђхолоднымї (т.е. нерадиоактивным) тимидином до заданной величины, чтобы избежать Ђтимидинового самоубийстваї живых клеток. √отов€т матричный раствор тимидина в культуральной среде: как правило, его концентраци€ составл€ет 20 мк ю/мл. ≈сли эксперимент провод€т in vitro в лунках с объемом 200 мкл, то в каждую лунку внос€т по 25 мкл матричного раствора 3Ќ-тимидина, что создает его рабочую концентрацию 0,5 мк ю на лунку.  оличество клеток в лунке при этом, как правило, составл€ет 1-5×105.

 

B. ѕо завершении культивировани€ в присутствии 3Ќ-тимидина клетки удал€ют из лунок прибором харвестером на непроницаемые дл€ клеток микропористые фильтры, геометрически соответствующие формату лунок культуральных плашек. ‘ильтры промывают от невключившегос€ в клеточную ƒЌ  3Ќ-тимидина, после чего сушат при 60-80 ∞— под инфракрасной лампой или феном.

√.  аждый фильтр помещают в индивидуальный флакон с сцинтилл€ционной жидкостью и в специальном счетчике β-частиц просчитывают число импульсов в минуту (срт) и определ€ют индекс стимул€ции. ≈го значение и €вл€етс€ количественным показателем уровн€ пролиферации исследуемых клеток. ѕоказатели эксперимен-

тальных лунок сравнивают с контрольными и рассчитывают статистическую достоверность различий.



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
¬ыделение клеток методом проточной цитометрии | ќценка клеточной цитотоксичности
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 516 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ћибо вы управл€ете вашим днем, либо день управл€ет вами. © ƒжим –он
==> читать все изречени€...

1939 - | 1693 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.012 с.