Применение метода УФ-спектроскопии в молекулярной биологии и биофизике.

Метод УФ-спектроскопии используют как для идентификации веществ (например, оснований аденин, тимин, гуанин, цитозин в нуклеотидном составе ДНК), так и для количественного анализа. Например, для определения содержания ДНК в бактериофагах или концентраций бактерий. Также его можно использовать для определения структурных параметров макромолекул (например меры a - спиральности белка). По спектральным измерениям можно контролировать взаимодействие молекул белка и определять условия, кинетику этого процесса.

Методом УФ-спектроскопии исследуют переходы спираль – клубок в белках или двухцепочечной ДНК: денатурацию и ренатурацию при изменении рН, температуры, ионной силы. Хромофор, спрятанный внутри белка при денатурации (разворачивании макромолекулы) становится доступным растворителю, что сопровождается гиперхромизмом.

Одно из применений УФ-спектроскопии - спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необходимость определения величин рК диссоциации протонов ионизуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке. Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации меняется спектр одного из хромофоров (например в случае тирозина). Рассмотрим гипотетический тирозинсодержащий белок и для определения числа внешних тирозиновых остатков воспользуемся правилом 2. Предположим, что в этом белке имеется пять тирозиновых остатков. Если все они расположены на поверхности и ионизуются при увеличении рН, спектр, отвечающий остаткам тирозина, будет приближаться к спектру свободного тирозина при высоких значениях рН, изображённому на рисунке 13. Другими словами зависимость D₂₉₅ (l_макс для ионизованной формы) от рН будет выглядеть, как кривая А на рисунке 13. Когда же, наоборот, три тирозиновых остатка расположены внутри в неполярном окружении, полученная кривая аналогична кривой Б; отношение величины первого плато к конечной величине равно» 2/5. Отметим, что при очень высоких рН на кривой видно большое возрастание D₂₉₅. Это указывает на то, что внутренние тирозиновые остатки стали доступны растворителю, т.е. белок развернулся (денатурировал). Если бы три внутренних тирозиновых остатка были в полярном окружении, то получили бы кривую, похожую на кривую В (рис.13), которая указывает, что эти три остатка имеют значение рК, отличное от такового для экспонированных групп.

Рис. 13 Кривые титрования тирозина, при построении которых использовали e295. Гипотетический белок содержит 5 тирозиновых остатков. А – все пять остатков находятся на поверхности, Б – два остатка на поверхности, а три внутри, в неполярном окружении, и, следовательно не титруются. В- три внутренних остатка находятся в полярном окружении и доступны растворителю.

Список литературы

1. Свердлова О.В. Электронные спектры в органической химии. Л. Химия, 1973.

2. Иоффе Б.В., Костиков Р.Р., Разин В.В. Физические методы определения строения органических молекул. Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1976.

3. Вилков Л.В., Пентин Ю.А.Физические методы исследования в химии - Структурные методы и оптическая спектроскопия. М.: Высшая школа, 1987

4. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии. М.: Мир, 1980

5. Биополимеры./ под. ред. Ю.Иманиси М: Мир, 1988

6. Волькенштейн М.В. Биофизика. М: Наука, 1981