Спектр поглощения хромофора определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако lмакс и e претерпевают заметные изменения и под влиянием окружения. Имеется в виду влияние рН, полярности растворителя или соседних молекул и относительная ориентация соседних хромофоров. Именно эти факторы лежат в основе использования абсорбционной спектроскопии для характеристики макромолекул. Влияние окружения состоит в следующем.
а) Эффект рН. РН раствора определяет ионную форму ионизируемых хромофоров. На рис. 5 показан пример, иллюстрирующий влияние рН на спектр тирозина.
| Рис. 5 Спектр поглощения тирозина при рН 6 и 13. Отметим, что, как lмакс, так и e возрастают при диссоциации ОН-группы фенольного остатка. |
б) Эффект полярности. В случае полярных хромофоров часто справедливо (особенно если молекула содержит О, N или S) что lмакс наблюдается при более коротких длинах волн в полярных растворителях, содержащих гидроксил (Н2О, спиртах), чем в неполярных. Пример приведен на рис. 6.
| Рис. 6. Влияние полярности растворителя на спектр тирозина. Растворители: вода (сплошная линия) и 20%-ный этиленгликоль (штриховая линия). Отчётливо видно возрастание lмакс в менее полярном растворителе |
в) Эффекты ориентации. Величины lмакс и e существенно зависят от геометрических особенностей молекул. Наиболее известна гипохромия нуклеиновых кислот, т. е. понижение коэффициента погашения нуклеотида, при условии, что нуклеотид входит в состав одноцепочечного полинуклеотида, в котором нуклеиновые основания сближены и расположены друг над другом. Дальнейшее понижение e наблюдается для двухспиральных полинуклеотидов, т.к. основания в этом случае ещё более упорядочены. Это показано на рис. 7.
| Рис 7. Спектры поглощения ДНК фага Т7 в двухцепочечной (1) и одноцепочечной (2) формах, а также после гидролиза до свободных нуклеотидов (3), показывающие понижение оптической плотности (гипохромию), которое сопровождает образование более упорядоченной структуры. Спектры получены при одинаковой концентрации. |
В результате исследования большого числа биологически важных соединений и макромолекул, структура которых хорошо известна для различных условий, собран ряд эмпирических фактов, которые могут быть названы рабочими правилами абсорбционной спектроскопии в биохимии [4]. Они приведены ниже:
1. Если аминокислоты: триптофан, тирозин, фенилаланин и гистидин – перемещаются в менее полярное окружение, lмакс и e возрастают. Следовательно:
- если в снятом в полярном растворителе спектре аминокислоты, находящейся в составе белка, наблюдаются бóльшие lмакс и e, чем эти же величины для свободной аминокислоты в том же растворителе, то эта аминокислота находится во внутренней области белка ("спрятана") и окружена неполярными аминокислотами.
- если спектр белка чувствителен к изменению полярности растворителя, аминокислота, для которой наблюдаются изменения lмакс и e, должна располагаться на поверхности белка.
2. В случае аминокислот lмакс и e всегда возрастают, когда титруемая группа (например, ОН тирозина и SH цистеина) заряжена. Следовательно:
- если не наблюдается изменений в спектре одной из этих аминокислот, а рН таково, что должна бы происходить ионизация свободной аминокислоты, то она должна быть спрятана в неполярной области молекулы белка.
- если значение рК ионизируемой группы аминокислоты, определённое по изменению спектра при изменении рН, такое же, как для свободной аминокислоты в растворе, то эта аминокислота находится на поверхности белка.
- если значение рК, определённое по изменению спектра при изменении рН, существенно другое, то эта аминокислота, вероятно, находится в очень полярном окружении (например, тирозин, окружённый карбоксильными группами).
