Количественный анализ в спектрофотометрической практике основан на использовании закона Ламберта-Бера:
где I0 – интенсивность падающего света (квант с-1);
I – интенсивность света, прошедшего через раствор или пленку образца; D – поглощение раствора (безразмерная величина) или оптическая плотность или экстинкция, e - коэффициент молярной экстинкции, отнесенной к единице толщины поглощающего слоя (1 см) и единице концентрации исследуемого раствора С=1 моль/л; l -толщина поглощающего слоя.
 |
Из уравнения:
Коэффициент экстинкции e является постоянной величиной для данного соединения при данной длине волны. При больших значениях e удобно пользоваться его логарифмом lg e.
Между поглощением (D) и пропусканием (Т) существует следующая зависимость:
 |
Современные двухлучевые спектрометры позволяют непосредственно записывать поглощение или пропускание. Спектры поглощения строятся так, что на ординате откладывается поглощение (D) (или lg e) или пропускание (T), а на оси абсцисс – длина волны l.
В спектрофотометрии также используются такие показатели, как:
Если известны коэффициенты молярной экстинкции (e), толщина кюветы (l), и поглощение (D), то концентрацию хромофорного вещества можно найти количественно, используя закон Ламберта-Бера.
В некоторых случаях, если концентрация велика, e становится функцией С и тогда можно сказать, что закон Бера нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например, димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях (рис. 2)
|
| Рис 2. Положительное и отрицательное отклонение от закона Бера и причины отклонений. а - спектральный сдвиг, связанный с возрастанием концентрации, часто в результате полимеризации. Отметим, что при длине волны l2 не наблюдается изменения молярного коэффициента погашения при изменении концентрации. Эта длина волны соответствует изобестической точке; б - кривая, показывающая отклонения от закона Бэра. При l1 отклонение положительное (1). при l3- отрицательное (2). В изобестической точке при l2 закон всегда соблюдается (3). |
