Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. (При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов). Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света и измерительного прибора или самописца для регистрации выходного сигнала детектора (рис 3.). Ход работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через растворитель (который может быть буфером), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. На практике прибор настраивают таким образом, чтобы он показывал нулевое поглощение при измерении одного растворителя (это называется настройкой прибора на нуль). Осуществив такую настройку, можно снимать показания, соответствующие непосредственно поглощению образца.
|
| Рис 3. Схематическое устройство спектрофотометра. Свет от лампы 1 проходит через монохроматор 2 для выделения пучка света с определённой длиной волны. Образец 3 и растворитель 4 содержатся в двух кюветах, помещённых в держатель кювет 5. Свет проходит через кювету и падает на фотоэлемент 6, выходной сигнал которого регистрируется измерительным прибором 7. Держатель кюветы находится на направляющих 8, так что каждая кювета может быть независимо помещена в пучок лучей. |
Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся и различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучении. При этом на самописце вычерчивается спектр.
