Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ќпределение чувствительности по методу серийных разведений




 омпоненты, мл ѕробирки
                контроль бактерий контроль антибиотика
ћѕЅ 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
ѕенницилин, 100 ќƒ/мл 2,0 - 2,0
 онцитраци€ антибиотика, ќƒ/мл     12,5 6,3 3,2 1,6 0,8 0,4 -  
—успензи€ бактерий, 105 /мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -
»нкубаци€ в термостате при 370 — 18-24 ч
–езультат                    
                     

 

 

—реду предварительно разливают в пробирки по 2 мл. ¬ первую добавл€ют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают и перенос€т к следующей пробирке, продолжа€ разведение к предпоследней, из которой удал€ют 2 мл смеси. ѕоследн€€ пробирка служит контролем роста культуры. ¬ том жебульйони, который используют дл€ разведени€ антибиотиков, готов€т суспензию суточной агаровой или бульйоннои культуры бактерий из расчета 105-106 микробных тел в 1 мл в зависимости от вида возбудител€. ѕотом к каждой пробирке с разведени€ми, а также к контрольной добавл€ют по 0,2 мл изготовленной суспензии. ѕри определении чувствительности к пеницилинив пеницилиназоутворюючих стафилококков рекомендуют использовать одновременно большую и малую микробную нагрузку (100, 100000 и выше микробных тел в 1 мл). ¬ зависимости от величины посевной дозы значени€ ћѕ  препарата может колебатьс€: при увеличении дозы чувствительность снижаетс€ за счет роста количества пеницилинази, что образуетс€ в среде.

ѕробирки инкубируют в термостате при 37 ∞— в течение 18-24 год. –езультаты учитывают, определ€€ наличие или отсутствие роста в среде с разными разведени€ми препарата.

 

ѕоследн€€ пробирка, в которой наблюдают задержку роста культуры (прозрачный бульйон), отвечает ћѕ  (минимальной подавл€ющей концентрации) или ћЅс  (минимальной бактериостатической концентрации) препарата относительно данного микроба и указывает на степень его чувствительности.

 

≈сли признаки роста по€вл€ютс€ во всех пробирках, исследуемый штамм резистентный к максимальной концентрации препарата, котора€ была вз€та в опыт. ќтсутствие роста бактерий во всех пробирках, кроме контрольной, свидетельствует, что ћѕ  препарата ниже, чем и, что используетс€ в опыте.

 

ƒл€ определени€ бактерицидного эффекта антибиотика из нескольких последних пробирок, в которых нет признаков роста, делают висел на секторы агара в чашках ѕетри.

„ерез 24-48 год инкубации при оптимальной температуре отмечают ту наименьшую концентрацию препарата в пробирке, зан€л из которой

 

VIDEO

 

ѕринцип метода серийных разведений в плотной питательной среде аналогичен предыдущему. ƒл€ этого готов€т серию разведений антибиотика в агаре, добавл€€ один объем, который содержит определенное количество препарата до 9 объемов агара. ƒл€ этого удобно разлить агар во флаконы или широкие пробирки по 13,5 мл. ѕеред постановкой агар расплавл€ют на вод€ной бане и после охлаждени€ до 60-65 ∞— в каждую пробирку добавл€ют 1,5 мл соответствующего разведени€ антибиотика (в бульйоне), тщательным образом перемешивают и выливают в чашку ѕетри. ¬ контрольную пробирку с агаром вместо раствора антибиотика внос€т 1,5 мл дистиллированной воды. „ашку раздел€ют на секторы, на каждый из которых засевают исследуемый штамм. ѕосевы делают бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. ƒл€ посева удобно использовать специальный штамп-репликатор, который позвол€ет нанести одновременно на поверхность агара 25-50 исследуемых культур. –езультаты учитывают после 18-24 год инкубации в термостате при оптимальной температуре.

 

«а ћѕ  (минимальную подавл€ющую концентрацию) антибиотика дл€ данного штамма принимают ту, при которой отсутствуют признаки роста колоний на поверхности агара (или вместо бл€шки есть рост одиночных колоний).

 

»з двух способов определени€ антибиотикочутливости микробов до антибиотиков (разведений в густой и жидкой средах) точнее €вл€етс€ метод серийных разведений в жидкой среде. –езультаты, которые получают с помощью разведений в агаре, менее посто€нны. ћетод не следует примен€ть при оценке чувствительности тех микробов, которые дают тонкий, разрежен рост на поверхности чашки (стрептококки, пневмококки) или, напротив, имеют тенденцию к ползучему росту (протей).

Ќедостатком методов серийных разведений €вл€етс€ их высока€ трудоЇмнисть, что ограничивает использование в обычных бактериологических лаборатори€х. — целью упрощение было предложено модификацию метода с заменой р€да из 10 пробирок, которые содержат разные количества препарата, трем€ концентраци€ми антибиотика. ѕерва€ из них отвечает максимальной, что находитс€ в крови при введении терапевтических доз, втора€ Ц уровню, который наблюдаетс€ через “1/2 (врем€ снижени€ концентрации антибиотика на 50 %). “реть€ €вл€етс€ минимальной, то есть той, котора€ равн€етс€ ћѕ  дл€ высокочувствительных штаммов. ¬ соответствии с использованными концентраци€ми антибиотиков исследуемые штаммы можно отнести за уровнем чувствительности до трех основных групп: резистентные (ћѕ  дл€ которых превышает значение максимальной концентрации антибиотика в крови), умеренно чувствительные (значени€ ћѕ  приближаютс€ к максимальной или средней концентрации) и высокочувствительные (чувствительность которых к антибиотику находитс€ на уровне минимальной концентрации, котора€ используетс€ в опыте). “акими концентраци€ми при определении чувствительности к бензилпеницилину €вл€етс€ соответственно 0,05-0,2, 0,5 и 2,0 ќƒ/ћЋ, к макролидам Ц 0,1, 0,5-1,0 и 4,0 мкг/мл, к аминогликозидив Ц 0,5-1,0, 6,0-8,0 и 15,0-20,0 мкг/мл.

”скоренные методы определени€ чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. »спользу€ обычные методы, ответ может быть получен через 18-20год от начала исследовани€, не учитыва€ этапов выделени€ чистой культуры. Ёто приводит к тому, что в большинстве случаев особенно при зат€жном и т€желом течении болезни, лечение антибиотиками начинают задолго до получени€ данных лабораторного обследовани€. ¬ зависимости от принципов, на которых они базируютс€, ускоренные методы предусматривают:

Х определение изменений ферментативнои активности микроорганизмов под воздействием антибиотиков;

Х определение цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно восстановительного потенциала во врем€ роста бактерий в питательной среде;

Х цитологичну оценку изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков.

 

  первой группе принадлежит метод –оджерса, ориентированный на способность антибиотиков подавл€ть ферментативну активность чувствительных микроорганизмов, котора€ сопровождаетс€ изменением цвета соответствующего индикатора. —уть его заключаетс€ в дифференцированном изменении красного цвета фенолового красного на желтый или фиолетовый в зависимости от чувствительности исследуемого штамма. ¬ случае чувствительности к действию антибиотика не происходит разложение глюкозы при культивировании в среде, которое содержит ее и определены концентрации препарата. ѕри этом среда окрашиваетс€ в фиолетовый цвет в результате сдвига рЌ в щелочную сторону. »зменение красного цвета на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, резистентного к действию антибиотика. ≈сли к среде прибавить 0,25 % дрожжевого экстракта, результаты могут быть учтенными уже через 2-2,5 год от начала исследовани€.

—ледующа€ группа методов регистрирует изменени€ окислительно восстановительного потенциала среды в процессе роста микроорганизмов, о чем свидетельствует изменение цвета резазурина, 1,3,5-трифенилтетразоли€ хлорида, 2,6-дихлорфенолиндофенола и других, которые добавл€ютс€ к среде. Ётот метод технически простой, а результаты получают через 2-6 год. ѕринцип его сводитс€ к тому, который растоплен и охлажден до 50 ∞— агар засевают исследуемой культурой бактерий из расчета 200 млн. микробных тел, а на поверхность налагают диски с антибиотиками. „ашки инкубируют при оптимальной температуре в течение 3-5 год, потом обрабатывают индикатором и повторно инкубируют при 37 ∞— в течение 20-30 хв. –езультаты учитывают за изменением цвета вокруг дисков с антибиотиками. ≈сли используют 1 % раствор 1,3,5-трифенилтетразоли€ хлорида, участка агара с бактериальным ростом в результате образовани€ формазануприобретают красный цвет, а зоны притеснени€ роста вокруг дисков остаютс€ бесцветными.

—удить о степени чувствительности микробов к антибиотикам можно с такой же точностью, как и с помощью стандартного метода дисков, однако врем€ исследовани€ уменьшаетс€ до 3-5 год.

ќбразование инволюционных форм бактерий под воздействием антибиотиков исследуют под фазово-контрастным или антоптральним микроскопом в специальных микрокапсулах. ќни образуютс€ в результате действи€ бактериостатичних концентраций препарата. ѕод воздействием суббактериостатичнихконцентраций, а также при резистентности исследуемого штамма на поверхности агара вырастают нормальные микроколонии.

ћетод может быть применен дл€ определени€ чувствительности штаммов кишечной палочки, стафилококков, холерных вибрионов. ѕолученные даны в большинстве случаев совпадают с теми, которые дают классические методы.

«а последние годы разработаны многочисленные модификации метода серийных разведений в питательных бульйонах. ¬ частности, экспресс-методы с титрованием антибиотика в объеме 0,25 мл.

¬ыпускаютс€ коммерческие наборы длительного хранени€, которые состо€т из планшетов из лиофильно высушенными разведени€ми антибиотика, куда вноситс€ по 0,1 мл суспензии чистой культуры микроорганизмов. –езультаты определени€ антибиотикочутливости можно оценивать визуально (при наличии в среде индикатора) или с помощью спектрофотометров, когда регистрируетс€ изменение оптической плотности среды.

ќпредел€ть чувствительность бактерий к антибиотикам можно и с помощью автоматизированных микробиологических систем (УAutobac MS-2Ф, УCobas MicroФ,Quantum 2, Sceptor и др.). ѕри их использовании результаты получают уже через 3-10 год. ќдно из их преимуществ заключаетс€ в том, что они позвол€ют получать результаты одновременно до 18-20 антибиотиков. Ёти методы широко используют в микробиологических лаборатори€х, они хорошо коррелируют с другими методиками и за их помощью можно не только выбирать рациональную схему антибиотикотерапии, но и проводить эпидемиологический контроль резистентности.

ќднако при пользовании такими автоматизированными системами частота вы€влени€ резистентных штаммов может быть снижена в результате медленного роста устойчивых вариантов. ¬ большинстве подобных систем результаты учитывают путем сравнени€ роста (или гибели) бактериальных клеток в присутствии антибиотиков с контролем, где есть только микробы. ѕри этих услови€х достаточно трудно дифференцировать клетки, которые погибают, от тех, что медленно размножаютс€.

  другим факторам, которые вли€ют на результаты, принадлежит действие субингибиторних концентраций препаратов на ультраструктуру бактериальных клеток. ќни привод€т к изменению формы, набухани€ клеток, которое может сопровождатьс€ изменением оптической плотности суспензии и искажением результатов. ¬ свою очередь, это дает неправильную информацию о чувствительности возбудителей.

“аким образом, применение любого метода позвол€ет определить антибиотикограму возбудител€ Ц спектр его чувствительности и антибиотикостийкости.

¬се методы определени€ чувствительности бактерий к антибиотикам имеют свои преимущества и свои недостатки. ѕотому посто€нный контроль за объективностью результатов и соблюдением правил проведени€ исследований способствуют получению достоверных данных.

 

¬ большинстве случаев результаты определени€ антибиотикоустойчивости in vitro совпадают с клиническими последстви€ми антибиотикотерапии. —лучаи разногласи€ объ€сн€ютс€ р€дом причин, среди которых чаще всего встречаетс€ ошибочна€ трактовка полученных лабораторных данных.

ѕричиной таких ситуаций может быть использование при посеве не чистой культуры бактерий, а патологического материала. ѕотому определ€етс€ не чувствительность инфекционного агента, а микробной ассоциации, в том числе и сапрофитной флоры. ќшибки встречаютс€ при исследовании содержани€ двенадцатиперстной кишки, фекалиий, харкотинн€, выделений из ран, мочи и тому подобное.

ѕлазмиды делают бактерии нечувствительными к подавл€ющему большинству антибиотиков, которые используютс€ в клиниках, поскольку кодируют синтез ферментов, которые разрушают препараты. ќдним из наиболее исследованных ферментов €вл€етс€ бета-лактамаза, котора€ разрушает антибиотики, которые принадлежат к группе бета-лактамив. –азработано несколько методических приемов, которые позвол€ют быстро определить ее активность. ќдин из них заключаетс€ в том, что на фильтровальную бумагу размером 2х2 см, который находитс€ в чашке ѕетри, капают одну каплю 2 % водного раствора крахмала. ѕотом на эту бумагу нанос€т петлей агаровую культуру микробов и растирают ее, формиру€ бл€шку диаметром до 5 мм. Ќа ее поверхность нанос€т рабочий йодный растворпенициллина.

”чет результатов провод€т через 10 минут инкубации системы при комнатной температуре. ѕри наличии бета-лактамазы на темно-синем фоне наблюдаетс€ €рко выраженна€ четка€ зона просветлени€ вокруг бл€шки, котора€ содержит агаровую культуру микробов. ѕри негативном результате зона просветлени€ отсутствует, а кра€ бл€шки нечетки.

ќпределение концентрации антибиотиков в биологических жидкост€х. ѕри т€желых инфекционных процессах, например, сепсисе иногда придетс€ определ€ть концентрацию антибиотиков в биологических жидкост€х, в частности, сыворотке крови, мочи. ƒл€ этого используют метод серийных разведений в жидкой среде с глюкозой и индикатором јндреде. ¬ двух параллельных р€дах готов€т серийные разведени€ сыворотки и стандарта антибиотика. ѕотом к каждой пробирке, включа€ контрольные, добавл€ют стандартную суспензию тестовых микробов. ѕробирки инкубируют в термостате при температуре 37 ∞— в течение 18год. ¬ тех пробирках, где концентраци€ антибиотика подавл€ет микробов, среда остаетс€ бесцветной и прозрачной. ≈сли микроорганизмы прорастают, об этом свидетельствует помутнение среды и по€вление розовой расцветки.

ћожно использовать также фенол-сироваткове среду с индикатором феноловым красным. ¬ этом случае при отсутствии роста микроорганизмов среда остаетс€ красной, а при наличии признаков роста становитс€ мутным и приобретает желтый цвет.

»сход€ из данных таблицы, раствор стандарта пенициллина задерживает рост тестовых микробов в концентрации 0,025 ≈ƒ/ћЋ, а исследуема€ сыворотка Ц в разведении 1:8. —ледовательно, содержание пеницилина в сыворотке крови будет равн€тьс€ 0,2 ќƒ/ћЋ (0,025 ≈ƒ/мл).

ќпределение концентрации пенициллина в сыворотке крови

ѕробирки          
–азведение сыворотки 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
–ост тест-микробов - - - + +
 онцентраци€ стандарта пенициллину в среде ќƒ/мл 0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125
–ост тест-микробов - - - - +

 

 





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-05-07; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 1015 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

≈сли президенты не могут делать этого со своими женами, они делают это со своими странами © »осиф Ѕродский
==> читать все изречени€...

736 - | 676 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.016 с.