Как в отечественной, так и в зарубежной нормативной документации для количественного анализа применяют спектрофотометрию в УФ области. Все испытания выполняют, защищая испытуемые лекарственные вещества от попадания прямого солнечного света. В водных растворах рибофлавин имеет 4 максимума поглощения (223, 267,370, 445 нм). Используя в качестве растворителя воду с добавлением уксусной кислоты и ацетата натрия, выполняют спектрофотометрическое определение рибофлавина при длине волны 267 нм. Расчёт выполняют по удельному показателю поглощения (328) рибофлавина при длине волны 444 нм, а затем умножают на коэффициент пересчёта. Для этой цели используется стандартный образец.
Способы количественного определения титриметрическими методами основаны на использовании кислотно-основных и окислительно-востановительных свойств.
Для количественного определения применяют алкалиметрическое определение рибофлавина после его реакции с нитратом серебра, а также цериметрию с йодометрическим окончанием и метод Кьельдаля (содержание азота 14,5-15,2%). Предполагают, что под действием нитрата серебра происходит замещение водорода иминогруппы ионом серебра с выделением эквивалентного количества азотной кислоты, которую оттитровывают щёлочью (индикатор бромтимоловый синий). При цериметрическом определении 0,02 М раствором сульфата церия (IV) окисляют рибофлавин при кипячении (в течение 1 минуты). Затем после охлаждения добавляют иодид калия и титруют выделившийся йод.
Селективными, позволяющими количественно определить содержание рибофлавина, являются методики, базирующиеся на реакциях по рибитильному радикалу, влияющему на витаминную активность.
Одна из таких методик основана на окислении рибофлавина 0,02 М раствором периодата калия в нейтральной среде при комнатной температуре с образованием муравьиной кислоты. Её количество эквивалентно взятому на определение рибофлавину:
+KIO4 
+HCOOH
Выделившуюся муравьиную кислоту оттитровывают алкалиметрическим методом:
HCOOH + NaOH HCOONa + H2O
Второй способ определения рибофлавина по рибитильной части молекулы основан на этерификации концентрированной серной кислотой, При этом за счёт гидроксильных групп происходит образование моно-, ди-, три-, тетрасульфокислотных эфиров. Затем потенциометрическим титрованием раствором гидроксида калия устанавливают избыток серной кислоты. Реакция протекает стехиометрически в соотношении 1:3.
