ПРОСТІ ТА СКЛАДНІ МЕТОДИ ФАРБУВАННЯ ПРЕПАРАТІВ
Мета заняття:
— навчитися виготовляти мазки-препарати для мікроскопічного дослідження;
— навчитися фарбувати мазки-препарати простим і складними методами;
— навчитися мікроскопіювати мазки-препарати;
— навчитися трактувати результат мікроскопічного дослідження.
Оснащення: світловий мікроскоп, імерсійне масло, в'язкий матеріал (мокротиння або гній), кров, бульйонна культура ешерихій, агарова культура стафілокока, ізотонічний розчин натрію хлориду, предметні стекла, пінцет, бактеріологічна петля, спиртівка, сірники, маркер, банка з ватою, посудина для фарбування, вода для промивання препаратів, барвники (фуксин Пфейффера, метиленовий синій, папірці, пофарбовані за Синьовим, розчин Люголя), 96 % етиловий спирт, фільтрувальний папір для висушування препаратів, пуста чашка Пе-трі, гумові рукавички.
^ План
1. Матеріал для мікроскопічного дослідження.
2. Поняття про тинкторіальні властивості мікроорганізмів.
3. Виготовлення мазків-препаратів із патологічного матеріалу.
4. Виготовлення мазків-препаратів із культури мікроорганізмів.
5. Фарбування препаратів простим методом і за Грамом.
6. Ознайомлення з методикою фарбування препаратів для виявлення капсул, кислото-, спирто- та лугостійких бактерій, спор, включень.
Хід заняття 1. Матеріал для мікроскопічного дослідження
Виявлення патогенних мікроорганізмів в патологічному матеріалі за допомогою мікроскопа називається мікроскопічним методом лабораторної діагностики. Для мікроскопії використовують мокротиння, гній, кров, осад спинномозкової рідини і сечі, мазки зі слизових оболонок, зскрібок з уражених ділянок шкіри, уражене волосся, нігті, а також відбитки уражених органів.
2. Поняття про тинкторіальні властивості мікроорганізмів
Мікроорганізми мають настільки малі розміри, що вивчати їх у незабарвленому вигляді під світловим мікроскопом неможливо, до того ж вони прозорі. Тому частіше їх вивчають у забарвленому стані. Вивчення мікроорганізмів у пофарбованому препараті дає змогу не тільки вивчити їх форму, розміщення, а й виявити деталі структури клітини (спору, капсулу), а також хімічний склад, через те, що різні хімічні речовини проявляють різну спорідненість до барвників і після фарбування мають різний колір або різну інтенсивність забарвлення.
Здатність мікроорганізмів сприймати барвники називають тинкторіальною (від лат. ііпсіига — настоянка) властивістю.
3. Виготовлення мазків-препаратів із патологічного матеріалу
Для виявлення мікроорганізмів у патологічному матеріалі готують мазки на предметному склі. Предметні стекла готують заздалегідь. їх миють, знежирюють і зберігають в етиловому спирті або суміші Нікіфорова (суміш етилового спирту та діетилового ефіру 1:1) у широкогорлій банці з притертою пробкою. Перед роботою їх витирають насухо. Тримати скло слід І і II пальцями лівої руки за ребра.
Завдання 1. Виготовте мазок із в'язкого матеріалу (мокротиння або гною).
Увага! Під час роботи з патологічним матеріалом дотримуйтесь техніки безпеки.
Алгоритм "Виготовлення мазка із в'язкого матеріалу":
— протріть насухо 2 знежирених предметних стекла;
— поставте свій номер у верхньому лівому куті кожного скла;
— нанесіть пастерівською піпеткою патологічний матеріал на середину скла;
— накрийте його другим склом так, щоб 1/3 частина кожного скла була вільною, злегка притисніть (мал. 5);
— розведіть стекла в різні сторони, взявши їх за вільні кінці І і II пальцями обох рук;
— залиште мазки на столі для висихання.
Завдання 2. Виготовте мазок із крові. Алгоритм "Виготовлення мазка із крові":
— 
підготуйте 2 предметних стекла (одне з них повинно бути вужчим і мати шліфований вузький кінець);
— поставте свій номер на ширшому склі;
— нанесіть краплю крові пастерівською піпеткою на ширше скло ближче до правого кінця; поставте друге скло шліфованим кінцем у краплю крові, нахиліть його вправо під кутом 45°;
— проведіть ним по першому склу справа наліво на 3/4 скла (мал. 6);
— опустіть вузьке скло в дезінфекційний розчин;
— залиште мазок на столі для висихання.
Увага! Правильно виготовлений мазок повинен мати світло-рожеве забарвлення і бути рівномірним за товщиною.
Завдання 3. Виготовте препарат "товста крапля". Алгоритм "Виготовлення препарату "товста крапля":
— підготуйте 2 предметних стекла;
— поставте свій номер на одному з них;
— нанесіть пастерівською піпеткою краплю крові на середину підписаного скла;
— розмажте цю краплю кутом другого скла до величини монети вартістю 1 копійка;
— опустіть друге скло в дезінфекційний розчин;
— залиште препарат на столі для висихання.
Завдання 4. Ознайомтеся з методикою виготовлення мазків із слизу, взятого із ротоглотки (зіва), мазків-відбитків з органів і тканин, сечі, спинномозкової рідини.
1. Виготовлення мазка із слизу, взятого з ротоглотки.
Мазок із ротоглотки беруть стерильним тампоном з мигдаликів, роблять мазок на предметному склі, висушують на повітрі, фіксують хімічним способом.
2. Виготовлення мазків-відбитків з органів і тканин секцій-
ного матеріалу.
Поверхню органа припалюють нагрітими бланшами пінцета або нагрітим скальпелем. Зрізають поверхневий шар. З глибини вирізають невеликий шматочок тканини, беруть її пінцетом і прикладають поверхнею зрізу до предметного скла декілька
разів. Отримують послідовний ряд мазків-відбитків. Мазки фіксують хімічним способом.
3. Виготовлення мазків із сечі, ліквору (від лат. Іідиог — спинномозкова рідина).
Маленьку краплю рідини (сечі чи ліквору) бактеріологічною петлею наносять на предметне скло і розмазують до розміру монети вартістю 1 копійка. Висушують на повітрі, фіксують хімічним методом.
Увага! Мазки, виготовлені з в'язкого матеріалу і крові, після перевірки викладачем опустіть у дезінфекційний розчин.
4. Виготовлення мазків із культури мікроорганізмів
Мазки з культури мікроорганізмів виготовляють для вивчення їх морфології та тинкторіальних властивостей.
Увага! Під час роботи з живими культурами ретельно дотримуйтесь правил техніки безпеки.
Завдання 5. Виготовте мазок із бульйонної культури.
Алгоритм "Виготовлення мазка із бульйонної культури":
— підготуйте предметне скло, нанесіть контури майбутнього мазка;
— переверніть скло (нанесений контур знизу);
— у лівому верхньому куті скла поставте свій номер;
— зафламбуйте скло у полум'ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
— покладіть скло у кришку чашки Петрі;
— зафламбуйте бактеріологічну петлю, візьміть бульйонну культуру;
— нанесіть краплю культури на предметне скло, розітріть;
— зафламбуйте бактеріологічну петлю;
— залишіть мазок для висихання.
Увага! Висушувати мазки слід на повітрі. Під впливом високої температури структура мікробної клітини порушується.
Завдання 6. Виготовте мазок з агарової культури. Алгоритм "Виготовлення мазка з агарової культури":
— підготуйте предметне скло, нанесіть контури майбутнього мазка;
— переверніть скло (нанесений контур знизу);
— у лівому верхньому куті скла поставте свій номер;
— зафламбуйте скло у полум'ї спиртівки (скло тримати пінцетом);
— зафламбуйте бактеріологічну петлю;
— нанесіть краплю стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду на предметне скло;
— зафламбуйте бактеріологічну петлю;
— відкрийте лівою рукою чашку Петрі з ростом культури мікроорганізмів;
— притуліть бактеріологічну петлю до стінки чашки Петрі (охолодження петлі);
— візьміть петлею матеріал з однієї колонії;
Увага! Слід брати колонію мікроорганізмів, а не агар!
— закрийте чашку Петрі;
— нанесіть матеріал на суху поверхню скла поряд із краплею ізотонічного розчину натрію хлориду, розітріть;
— рівномірно розмішайте матеріал із краплею ізотонічного розчину натрію хлориду;
— зафламбуйте бактеріологічну петлю;
— залишіть мазок для висихання.
Увага! Мазок має бути тонким, прозорим, рівномірним, невеликим.
Фіксування мазків. Мазки фіксують для: закріплення матеріалу на склі, знезараження, кращого фарбування (вбиті мікроби краще поглинають барвник).
Для фіксації мазків використовують два способи: фізичний і хімічний.
Фізичний спосіб. Фіксацію проводять у полум'ї спиртівки протягом 6 с. Для цього скло беруть пінцетом або І і II пальцями правої руки і проводять тричі повільно через верхню частину полум'я мазком догори. Правильність фіксації перевіряють, торкаючись нижньою поверхнею скла тильної сторони лівої руки. Мазок повинен бути гарячим, але не обпікати руку.
Цим методом фіксують мазки, виготовлені з культури мікроорганізмів, за умови, що під час нагрівання не змінюється структура мікробної клітини.
Хімічний спосіб. Для фіксації використовують хімічні речовини: безводний метиловий спирт — фіксують протягом 5 хв, спирт етиловий 96 % — 10—15 хв, суміш Нікіфорова — 10— 15 хв, ацетон — 5 хв, суміш парів хлоридної кислоти і формаліну — декілька секунд.
Хімічним способом фіксують мазки, виготовлені із патологічного матеріалу, а також з культури в тому разі, коли під час нагрівання може порушитися структура бактеріальної клітини (капсульні форми бактерій, спірохети).
Зафіксований мазок називається препаратом.
Завдання 7. Зафіксуйте мазки, виготовлені з агарової і бульйонної культури, фізичним способом.
Алгоритм "Фіксація мазка фізичним способом":
— візьміть пінцетом предметне скло з висушеним мазком;
— проведіть тричі через верхню частину полум'я спиртівки;
— доторкніться нижньою поверхнею скла до тильної сторони лівої руки (перевірка правильності фіксації).
Увага! Забороняється залишати на відкритих місцях або в неопечатаних сховищах незафіксовані мазки після закінчення роботиі
5. Фарбування препаратів простим методом і за Грамом
Під час простого методу фарбування використовують один барвник — частіше це фуксин Пфейффера або метиленовий синій. Цей метод ще називається орієнтовним, оскільки його використовують тільки для виявлення мікробів у патологічному матеріалі, визначення їх кількості, форми, взаємного розташування.
Завдання 8. Пофарбуйте препарат, виготовлений з бульйонної культури, фуксином Пфейффера, та препарат, виготовлений із агарової культури, метиленовим синім.
Увага! Принцип фарбування однаковий.
Алгоритм "Фарбування препарату простим методом":
— помістіть препарат на підставку в посудину для фарбування;
— нанесіть барвник піпеткою так, щоб він закрив весь препарат;
— проконтролюйте термін дії барвника (фуксин Пфейффе-ра — 1—2 хв, метиленовий синій — 3—5 хв);
— промийте препарат водою;
— висушіть препарат фільтрувальним папером.
Метод фарбування мазків-препаратів за Грамом належить до складних методів, тому що на мазок наносять два барвники, один з яких є основним, а інший — додатковим. Ці методи називають ще диференціальними, оскільки вони дають змогу розрізнити окремі групи бактерій, а також виявити хімічний склад і структуру бактеріальної клітини.
Завдання 9. Виготовте два мазки: перший — з культури ешерихій, другий — з культури стафілокока. Зафіксуйте їх фізичним способом і пофарбуйте препарати за Грамом.
Під час фарбування за Грамом бактерії поділяють на 2 групи: грампозитивні (забарвлюються в фіолетовий колір) та грам-негативні (забарвлюються в червоний колір). Різний колір забарвлення пояснюється різною будовою їх клітинної стінки. Основну частину клітинної стінки грампозитивних бактерій складає пептидоглікан — понад 90 %. Він має форму сітки. У грампозитивних бактерій він утворює 5—6, інколи до 40 шарів. Коли бактерії фарбують генціановим фіолетовим, а потім розчином Люголя, то утворюється нерозчинний у спирті і воді комплекс йоду з барвником. Цей комплекс не вимивається спиртом і водою через слабку проникність клітинної стінки (пептидоглі-кану). Грампозитивні бактерії залишаються забарвленими у фіолетовий колір. Дофарбовування препарату фуксином Пфейф-фера не змінює фіолетового кольору клітин мікрооганізмів.
У грамнегативних бактерій пептидоглікан утворює переважно один шар, зрідка — два. Тому комплекс генціанового фіолетового з йодом легко вимивається спиртом і водою, вна-
2 8-218
слідок чого бактерії знебарвлюються. Знебарвлені бактерії забарвлюються фуксином Пфейффера у червоний колір.
Алгоритм "Фарбування за Грамом":
— покладіть на мазок папірець, пофарбований за Синьовим, змочіть його водою — 2—3 краплі, витримайте 2 хв;
— зніміть папірець пінцетом, нанесіть розчин Люголя — 1 хв (до почорніння);
— нанесіть 96 % етиловий спирт — 20—ЗО с;
— промийте водою;
— нанесіть фуксин Пфейффера на 1—2 хв;
— промийте водою;
— висушіть препарат фільтрувальним папером.
Завдання 10. Підготуйте мікроскоп, розгляньте препарат, визначте форму, розміщення та колір бактеріальних клітин.
6. Ознайомлення з методикою фарбування препаратів для виявлення капсул, кислото-, спирто- та лугостійких бактерій, спор, включень
Для виявлення капсул, кислото-, спирто- та лугостійких бактерій, спор і включень використовують складні методи фарбування.
Для виявлення капсул препарат фарбують за Буррі—Гінсом. Для цього на предметному склі культуру змішують із краплею чорної туші, потім роблять мазок іншим предметним склом (як мазок із крові), висушують на повітрі, фіксують хімічним способом і, після промивання водою, наносять фуксин Пфейффера. Потім знову промивають водою і висушують на повітрі. Капсули містять понад 98 % води, тому погано утримують барвник. На темному фоні препарату капсули залишаються безбарвними, клітини бактерій набувають червоного кольору.
Для виявлення кислотостійких мікобактерій туберкульозу, лепри, а також деяких актиноміцетів застосовують фарбування препарату за Цілем—Нільсеном. У цих мікроорганізмів у клітинній стінці міститься багато (понад 40 %) ліпідів, воску, оксикислот, що зумовлює їх стійкість до кислот, лугів, спиртів. Вона також малопроникна для розведених барвників, тому для фарбування використовують концентрований барвник (фуксин Ціля), що містить протраву (5 % фенолу). Фарбування проводять при нагріванні (в кип'ячому шарі). За таких умов всі елементи препарату (клітини макроорганізму, стороння мікрофлора і кислотостійкі мікобактерії) набувають червоного кольору. Після оброблення препарату сульфатною кислотою і водою кислотостійкі мікобактерії залишаються червоного кольору, всі інші елементи препарату знебарвлюються. Другим барвником, розведеним метиленовим синім, фарбують без підігрівання, тому він всередину клітини кислотостійких мікобактерій не проникає і вони не змінюють червоного забарвлення. Всі інші знебарвлені елементи препарату набувають синього кольору. При мікроскопії на синьому фоні видно кислотостійкі мікобактерії червоного кольору.
Для виявлення спор препарат фарбують за Ожешко. Щоб барвник проник всередину спори, перед фарбуванням мазок обробляють кислотою для розпушування оболонки спори. Після промивання водою його фіксують і фарбують за Цілем— Нільсеном. Вегетативні клітини набувають синього кольору, спора — червоного.
Для виявлення включень препарат фарбують за Нейссером. Для цього на препарат наносять синьку Нейссера, потім розчин Люголя, після промивання водою на препарат наносять барвник везувін і знову промивають водою. Вегетативна клітина набуває жовтого кольору, зерна волютину — темно-коричневого. Цей метод фарбування використовують для виявлення зерен волютину (у коринебактерій дифтерії).
Завдання 11. Оформіть щоденник. Замалюйте в щоденнику кольоровими олівцями вигляд мікроорганізмів під мікроскопом.
Контрольні запитання
1. Яким вимогам мають відповідати предметні стекла, які використовують для виготовлення мазків?
2. Як виготовити мазок із в'язкого матеріалу?
3. Як виготовити із крові мазок, "товсту краплю"?
4. Як виготовити мазки із слизу, рідини?
5. Як виготовити мазки-відбитки з тканин і органів?
6. Яка різниця у виготовленні мазків з бульйонної та агарової культури?
7. З якою метою фіксують мазки?
8. Які є способи фіксації мазків? У яких випадках їх застосовують?
9. Чим відрізняється препарат від мазка?
10. Чому не дозволяється залишати на відкритих місцях незафіксовані мазки?
11. Які властивості мікроорганізмів називають тинкторі-альними?
12. Від чого залежить вибір барвника і методів фарбування мікроорганізмів?
13. Що таке простий метод фарбування? Які барвники для цього використовують?
14. Які методи фарбування називають складними? Чому їх називають диференціальними?
15. На які групи поділяють бактерії у разі фарбування за Грамом?
16. Чому під час фарбування за Грамом бактерії забарвлюються у фіолетовий або червоний колір?
17. Яку структуру бактеріальної клітини можна виявити у разі фарбування за Буррі—Гінсом?
18. Чому капсули не забарвлюються?
19. Які мікроорганізми виявляють у разі фарбування препарату за Цілем—Нільсеном?
20. Чому кислотостійкі бактерії не забарвлюються розведеними барвниками?
21. Чому під час фарбування за Цілем—Нільсеном різні бактерії забарвлюються в різний колір?
22. Які структури бактеріальної клітини виявляють у разі фарбування за Ожешко?
23. Для чого використовують фарбування за Нейссером? Який вигляд мають бактерії, пофарбовані цим мето-
дом?
Тести
1. Мазок перед фіксацією висушують:
а) на повітрі;
б) над полум'ям спиртівки;
в) за допомогою фільтрувального паперу;
г) всі відповіді правильні.
2. Не можна фіксувати фізичним способом мазок, виготовле-
ний із:
а) бульйонної культури стафілокока;
б) агарової культури стафілокока;
в) крові.
3. Під час фарбування за Грамом грампозитивні бактерії набу-
вають кольору:
а) червоного;
б) синього;
в) фіолетового;
г) блакитного.
4. Структура, від якої залежить фарбування мікроорганізмів
за Грамом:
а) ліпополісахарид;
б) цитоплазматична мембрана;
в) пептидоглікан;
г) поверхнева мембрана.
5. Для виявлення капсули у бактерій препарат фарбують за:
а) Буррі—Гінсом;
б) Грамом;
в) Цілем—Нільсеном;
г) Ожешко.
6. Для виявлення мікобактерій туберкульозу препарат фарбу-
ють за:
а) Буррі—Гінсом;
б) Грамом;
в) Цілем—Нільсеном;
г) Ожешко.
7. Для виявлення спори препарат фарбують за:
а) Буррі—Гінсом;
б) Грамом;
в) Цілем—Нільсеном;
г) Ожешко.
Ситуаційні задачі
1. У пофарбованому препараті виявили кулясті бактерії фіолетового кольору та паличкоподібні — червоного кольору. За яким методом пофарбований препарат?
2. У препараті, пофарбованому за Грамом, виявили бактерії кулястої форми, розміщені ланцюжком, фіолетового кольору, і паличкоподібні бактерії, розміщені безладно, червоного кольору. Які бактерії за формою, розміщенням, фарбуванням виявили в препараті?
3. У пофарбованому препараті виявили бактерії червоного кольору з безбарвним ободком. За яким методом пофарбовано препарат?
4. У пофарбованому за Нейссером препараті, виготовленому із слизу, взятого з ротоглотки, виявили паличкоподібні бактерії з потовщенням на кінці. Палички пофарбовані в жовтий колір, потовщений кінець — у темно-коричневий. Яка причина нерівномірного фарбування бактеріальних клітин?
5. Під час культивування грампозитивних стрептобацил сибірки за наявності пеніциліну паличкоподібна форма клітин змінюється на кулясту внаслідок того, що не синтезується клітинна стінка (феномен "перлинного намиста"). Як називається ця форма бактерій? Який колір мають ці клітини в препараті після фарбування за Грамом? Чому?
6. У препараті з мокротиння, пофарбованому за Цілем— Нільсеном, виявлено коки, розташовані у вигляді грона винограду, синього кольору, поодинокі короткі товсті палички синього кольору, тонкі довгі палички червоного кольору. До яких груп належать виявлені бактерії за формою клітини, розміщенням, фарбуванням?
7. Відомо, що мікобактерії туберкульозу після фарбування за Цілем—Нільсеном мають червоний колір. Якого кольору в препараті, пофарбованому за Цілем—Нільсеном, будуть мікобактерії туберкульозу в Ь-формі? Чому?
Домашнє завдання
Підготуйтесь до практичного заняття 3.
Рекомендації щодо самопідготовки до практичного заняття З
1. Ознайомтеся з темою і метою заняття, запишіть у щоденнику тему і план.
2. Вивчіть теоретичний матеріал (див. підручник, с. 39— 56; практикум, с. 39—55).
