Методы определения кислот в пищевых продуктах

В основе определения рН различных пищевых систем лежат стандартные методы, описанные в руководствах по аналитической химии. К ним относятся калориметрический и электрометрический методы.

Определение потенциальной кислотности, характеризующей общее содержание веществ, имеющих кислотный характер, основано на титровании этих веществ сильными основаниями (щелочами). Для различных пищевых продуктов характерны свои особые условия титрования, результаты которых представляют в соответствующих кислотных числах.

Анализ кислотного состава пищевого продукта дает возможность обнаружить фальсификацию или подтвердить его натуральность. Для определения содержания органических кислот используют как стандартные, так и альтернативные методы контроля.

Официальный метод анализа молочной кислоты основан на ее окислении перманганатом калия до уксусного альдегида, который определяют иодометрически. Наиболее известные методы определения винной

кислоты базируются на щелочном титровании выпадающего винного камня. Большинство органических кислот можно определить хромато-графическими методами.

К альтернативным относятся методы, основанные на использовании ферментативных систем. Характерными особенностями ферментативного анализа являются специфичность, обеспечивающая достоверность результатов, высокие точность и чувствительность.

Перечень органических кислот в составе пищевых продуктов, определяемых ферментативными методами, представлен в табл. 7.6.

Таблица 7.6. Пищевые кислоты в составе различных продуктов питания, определяемые ферментативными методами

Группа продуктов

Определяемая кислота

L-Аскорбиновая

L-Аспарагиновая

В-3-Гидроксимасляная

L-Глутаминова

D-Глюконовая

D-Изолемонная

Лимонная

L-Молочная

D-(L)Молочная

Муравьиная

Уксусная

Щавелевая

D-Яблочная

L-Яблочная

D-(L) Яблочная

Янтарная

Детское питание, диетические продукты

+

+

+

+

+

Пиво, вино, игристые и шампанские вина, спиртные напитки

+

+

+

+

+

+

+

+

Соки, нектары, сокосодержащие напитки, продукты переработки фруктов и овощей, безалкогольные напитки (например, лимонады)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Яйца и яичные продукты

+

+

+

Молоко и молочные продукты

+

+

+

+

+

+

Пищеконцентраты (например, супы, соусы)

+

Сахар и сахаросодержащие изделия

+

+

+

Мясо и мясные изделия

+

+

+

+

+

+

Использование ферментативных методов в аналитической химии органических пищевых кислот, в зависимости от группы анализируемых продуктов, может иметь различные цели, к которым относятся:

- производственный контроль;

- системы обеспечения качества;

- контроль качества готовой продукции;

- контроль сырья;

- оценка качества;

- анализ состава с целью установления пищевых свойств и их соответствия нормативной документации;

- оценка гигиенического статуса;

- мониторинг качества;

- выявление нежелательных компонентов;

- установление фальсификации;

- определение доли натурального сырья;

- определение аутентичности (подлинности).

Контрольные вопросы

1. Дайте общую характеристику кислот, входящих в состав пищевых продуктов.

2. Приведите примеры веществ, используемых в пищевой промышленности для регулирования рН пищевых систем.

3. В каких технологических функциях проявляется действие органических кислот в пищевых системах?

4. Каковы особенности органических кислот, применяемых в пищевых целях?

5. Приведите примеры биохимических изменений кислотности пищевой системы.

6. Дайте краткую характеристику методов, позволяющих определять кислоты в составе продуктов.

7. На какие технологические параметры оказывает влияние величина рН?

275:: 276:: 277:: Содержание

278:: 279:: Содержание

ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТЫ

Использование ферментов превратилось в важнейший промышленный принцип совершенствования пищевой технологии. Существенный вклад в это внесли достижения микробиологии и биохимии. Таким образом, производство продуктов питания в настоящее время превратилось из своего рода искусства в высокоспециализированную технологию, которая основывается на открытиях естественных наук.

Биохимические процессы, протекающие при хранении сырья и при производстве пищевых продуктов, связаны с действием естественных, собственных ферментов пищевого сырья, а также ферментов, вносимых в ходе технологического процесса в виде ферментных препаратов. Прежде всего это ферменты, продуцируемые различными микроорганизмами; кроме того, для получения ферментных препаратов используют проросшее зерно, ткани животных или тропические растения.

Еще на заре цивилизации человек сталкивался с различными ферментативными процессами и использовал их в своей практической деятельности. Спиртовое и молочнокислое брожение, применение сычуга при приготовлении сыров, использование солода и плесневых грибов для осахаривания крахмалистого сырья, применение заквасок при изготовлении хлеба - все эти ферментативные процессы хорошо известны с незапамятных времен.

В настоящее время многие отрасли промышленности - хлебопечение, виноделие, пивоварение, производство спирта, сыроделие, производство органических кислот, чая, аминокислот, витаминов, антибиотиков - основаны на использовании различных ферментативных процессов. Кроме того, препараты ферментов находят все более широкое применение в медицине и сельском хозяйстве. В связи с этим возникла и развивается новая отрасль промышленности - производство ферментных препаратов.

Общие аспекты применения ферментов в пищевой промышленности, а также вопросы, связанные с производством промышленных

ферментов, нашли широкое отражение в специальной учебной и научной литературе. Однако необходимо обратить особое внимание на то, что работа с ферментами, их использование требуют элементарной грамотности в вопросах ферментативной кинетики и способах регуляции ферментативной активности.

Кроме того, необходимо всегда учитывать наличие в сырье собственных эндогенных ферментов, которые в процессе приготовления пищевых продуктов могут оказывать различное действие (как положительное, так и отрицательное).

Вопрос об эндогенных ферментативных системах того или иного биологического сырья не рассматривается в данном разделе отдельно, но будет затрагиваться всякий раз, когда речь зайдет о совместном действии эндогенных ферментов и ферментных препаратов.

278:: 279:: Содержание

279:: 280:: 281:: Содержание

ОБЩИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы. Они значительно повышают скорость химических реакций, которые в отсутствие ферментов протекают очень медленно. При этом ферменты не расходуются и не претерпевают необратимых изменений.

Каким образом ферменты повышают скорость реакций? Они ускоряют химические реакции, находя "обходные пути", позволяющие молекулам преодолевать активационный барьер на более низком энергетическом уровне. Это становится возможным потому, что ферментативная реакция состоит из 2-х стадий: на первой стадии происходит образование фермент-субстратного комплекса, переходному состоянию которого соответствует значительно более низкая энергия активации; на второй стадии этот комплекс распадается на продукты реакции и свободный фермент, который может взаимодействовать с новой молекулой субстрата. Это можно выразить следующим уравнением:

E + S ↔ ES → P + E

где E - фермент, S - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс, P - продукты реакции.

Особенности ферментов. Ферменты, являясь по своей природе белками, обладающими третичной или четвертичной структурой, имеют ряд особенностей, которые отличают их от неорганических катализаторов.

В первую очередь, это огромная сила каталитического действия. Ферменты в 10⁸- 10²⁰ раз повышают скорость катализируемых ими реакций. Во-вторых, это специфичность действия ферментов. Они катализируют строго определенные реакции. Только

благодаря тончайшей специфичности ферментативного катализа возможна строгая упорядоченность и теснейшая взаимосвязь отдельных ферментативных реакций, лежащих в основе биологического обмена веществ.

По степени специфичности отдельные ферменты довольно сильно различаются между собой. Выделяют следующие основные типы специфичности:

- абсолютная специфичность - фермент катализирует превращение только одного субстрата;

- групповая специфичность - фермент действует на группу родственных субстратов, обладающих определенными структурными особенностями;

- специфичность по отношению к определенным типам реакций - такие ферменты обнаруживают наименьшую специфичность, они действуют независимо оттого, какие группы присутствуют вблизи той связи, на которую направлено действие фермента;

- стереохимическая специфичность - фермент катализирует превращение только одной стереохимической формы субстрата.

Третьей особенностью ферментов, как биологических катализаторов, является их лабильность. Они подвержены влиянию различных факторов и могут изменять свою активность под действием рН, температуры, присутствия активаторов и ингибиторов и др. Лабильность (или, иными словами, изменчивость) ферментов обусловлена их белковой природой, сложной пространственной конфигурацией (структурой).

Влияние этих факторов на активность ферментов и скорость катализируемых ими реакций будет рассмотрена в разделе кинетики.

Многие ферменты являются двухкомпонентными, то есть состоят из белковой части - апофермента и связанного с ним небелкового компонента - кофермента, участвующего в действии фермента в качестве обязательного кофактора. В результате ферментативных реакций коферменты, как правило, не подвергаются изменениям, однако при ряде последовательно протекающих реакций кофермент может представлять собой субстрат для отдельных ферментов, хотя и регенерируется в конечном счете в исходной форме.

Химическая природа коферментов, их функции в ферментативных реакциях и механизм действия чрезвычайно разнообразны. Так, например, в качестве коферментов могут выступать витамины и их производные.

В соответствии с химическим строением коферменты можно подразделить на следующие группы: а) коферменты алифатического ряда (глутатион, липоевая кислота); б) коферменты ароматического ряда (коэнзим Q - убихинон); в) коферменты - гетероциклические соединения (производные витаминов B₆, B₁, биотина - витамина H, производные

фолиевой кислоты); г) коферменты - нуклеотиды и нуклеозиды (коэн-зим А, НАД/НАДО, ФАД/ФАДФ).

Единицы активности ферментов. Любой ферментный препарат прежде всего должен быть охарактеризован по его ферментативной активности. Комиссия по ферментам Международного Биохимического Союза рекомендует использовать следующие понятия и выражения единиц активности ферментов.

- Стандартная единица фермента - это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Стандартная единица фермента обозначается буквой E (от русского слова "единица") или буквой U (от английского слова "unit").

- Уд ельная активность- это число единиц (E или U), отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментном препарате. Количество белка в препарате фермента может быть определено любым известным методом определения белка (метод Кьельдаля, метод Лоури и др.).

- Молекулярная активность - число молекул данного субстрата или эквивалентов затронутых групп, превращаемых за одну минуту одной молекулой фермента при оптимальной концентрации субстрата. Это понятие соответствует числу оборотов, введенных Варбургом. Число оборотов по Варбургу - это число молей превращенного субстрата, приходящееся на моль фермента за минуту. Для определения молекулярной активности фермента нужно знать его молекулярную массу.

- Катал - каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью равной 1 молю в секунду в заданной системе измерения активности. Каталитическая активность в 1 катал (кат) при практическом применении оказывается слишком большой величиной, по этому в большинстве случаев каталитические активности выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) или пикокаталах (пкат). Стандартная единица фермента находится с каталом в следующем соотношении: 1 E (U) = 16,67 нкат.

279:: 280:: 281:: Содержание

281:: 282:: 283:: 284:: 285:: 286:: 287:: 288:: 289:: 290:: 291:: 292:: 293:: 294:: 295:: Содержание

Ферментативная кинетика

Ферментативный катализ существенно отличается от неферментативного, в связи с чем в кинетике ферментативных реакций разработаны совершенно особые закономерности. Они позволяют выделить ферментативную кинетику в самостоятельный раздел химической кинетики, в котором изучается зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от концентрации реагирующих веществ (ферментов и субстратов) и от условий их взаимодействия (температуры, рН, концентрации

коферментов и кофакторов, наличия различных эффекторов: активаторов и ингибиторов).

Изучение кинетики ферментативного действия имеет важное теоретическое значение, поскольку только с позиций кинетики можно подойти к решению вопроса о механизме ферментативного действия. Но оно также необходимо с практических позиций, так как только имея определенные сведения о кинетике действия того или иного фермента, можно подобрать оптимальные условия для его работы, а также влиять на его активность в заданном направлении на различных стадиях технологического процесса.

Вопросы, связанные с кинетикой ферментативных реакций, детально изложены в специальных разделах биохимии и энзимологии, поэтому основное внимание уделим тем положениям, которые необходимы для грамотного подхода к работе с ферментами: подбору условий для определения активности фермента, определению начальной скорости ферментативной реакции, выбору субстрата, определению его насыщающей концентрации, оптимуму действия температуры и рН, влиянию кофакторов, активаторов и ингибиторов.

Наличие фермента в растворе или экстракте можно определить исходя из скорости катализируемой им реакции, о которой можно судить либо по накоплению продуктов реакции, либо по убыли субстрата.

В большинстве своем ферментативные реакции являются реакциями смешанного порядка. Типичная кривая хода ферментативной реакции (рис. 8.1) имеет следующий вид:

Рис. 8.1. Кривая хода ферментативной реакции во времени

Таким образом, ход ферментативной реакции во времени не может быть описан одним математическим уравнением, поскольку все ферментативные реакции в самом начале своего протекания (когда имеется избыток субстрата и образовалось мало продуктов реакции) являются

реакциями нулевого порядка, и только потом они приобретают характер реакции первого или второго порядка. Скорость реакции нулевого порядка со временем не меняется, зависимость количества образовавшегося продукта от времени остается прямо пропорциональной (см. рис. 8.2). Для реакций первого порядка скорость реакции в каждый данный момент времени пропорциональна имеющейся в наличии концентрации субстрата, а следовательно, наблюдается постоянное падение скорости реакции с течением времени (см. рис. 8.3).

Рис. 8.2. Графическое изображение реакции нулевого порядка

Рис. 8.3. Графическое изображение реакции первого порядка

Для того чтобы правильно определить потенциальные возможности данного фермента как катализатора, нужно учитывать скорость ферментативной реакции в тот момент времени, когда факторы, замедляющие скорость ферментативной реакции (нехватка субстрата, специфическое ингибирование продуктами реакции, частичная тепловая денатурация фермента и др.), не успевают проявить свое действие и наблюдается прямая пропорциональная зависимость между продуктами реакции и временем.

Такая скорость называется начальной скоростью ферментативной реакции и обозначается V₀.

На практике V₀ определяют графическим методом, для чего строят кривую хода ферментативной реакции во времени. Начальная скорость определяется как тангенс угла наклона касательной, проведенной из начала координат к кривой хода ферментативной реакции (см. рис. 8.1).

V₀ = tg a

При работе с конкретным ферментом длительность реакции следует выбирать исходя из экспериментальных данных, по начальной скорости реакции.

В зависимости от задачи, которая стоит перед исследователями или технологами, теми, кто работает с ферментами, выбирается тот или иной подход в этой работе. Имеется в виду следующее.

1. Если необходимо выделить и охарактеризовать фермент из какого-либо биологического объекта, пищевого сырья, следует применить либо известные схемы выделения и очистки, или разработать оптимальную схему для данного фермента, варьируя и испытывая различные сочетания основных этапов очистки и выделения ферментов (белков): экстракцию, различные режимы осаждения, гель-хроматографию и другие методы, основанные на различиях в физико-химических характеристиках отдельных ферментов (см. также гл. 2). При этом на каждом этапе выделения и очистки следует характеризовать ферментный препарат по ферментативной активности и содержанию белка. В этом случае определение ферментативной активности (определение F₀) проводят с использованием стандартного субстрата; выявляют оптимальные значения рН и температуры. И все дальнейшие исследования проводят при насыщающей концентрации субстрата, оптимуме температуры и рН. Изучение влияния специфических активаторов и ингибиторов позволяет в этом случае получить ценные сведения о строении активного центра и возможном механизме каталитического действия. Здесь необходимо подчеркнуть важность тщательного методического подхода при работе с ферментами. Не следует жалеть времени и усилий на выбор режима экстракции (продолжительность, температура, экстрагент, тип экстракции - исчерпывающая или нет), выбор методики определения активности, ее отработку и возможную модификацию для данного конкретного объекта исследования; кроме того, работа с ферментами различной степени очистки также имеет свои особенности, свою специфику: они обладают разной рН- и термостабильностью и, помимо этого, могут по-разному реагировать на воздействие различных факторов.

2. Если задача заключается в определении того, каким образом будет вести себя данный фермент (ферментный препарат) в конкретном режиме рассматриваемой пищевой технологии, необходимо проводить исследование ферментативного действия при условиях данного технологического процесса (концентрация субстрата, длительность, рН, температура, влажность), изучить влияние различных компонентов пищевого сырья и используемых добавок на активность фермента с целью определить возможность и способы влияния на ферментативный процесс в желаемом направлении.

Перейдем к рассмотрению факторов, влияющих на скорость ферментативных реакций.

Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции. Концентрация субстрата является важнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции. Еще в 1902г. В. Анри при изучении реакции ферментативного гидролиза сахарозы предположил, что фермент р-фруктофуранозидаза взаимодействует со своим субстратом, затем это

соединение распадается, фермент остается в первоначальном виде, а субстрат сахароза оказывается расщепленной на глюкозу и фруктозу.

Это предложение было в дальнейшем развито Л. Михаэлисом и M. Ментен. В 1913 г. они постулировали следующие уравнения ферментативной реакции:

где k₊₁ - константа скорости реакции образования комплекса ES, k_-1 k₊₂ - константы скорости реакции распада комплекса ES в двух направлениях.

Тогда K_s- константа диссоциации комплекса ES равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакции:

K_s=

k-1

k+1

 

Исходя из закона действующих масс, можно записать следующее уравнение:

[S] ·([E₀] -[ES]) = K_s ·[ES],

где [E₀] - концентрация фермента в начале ферментативной реакции, [S] - концентрация субстрата, (ES] - концентрация комплекса "фермент-субстрат", [E₀]-[ES] - концентрация фермента, не связанного в комплексе с субстратом.

В ходе ферментативной реакции в любой момент времени фермент существует в двух формах: свободной и связанной, т. е. в форме комплекса ES.

Скорость ферментативной реакции будет максимальной при такой концентрации субстрата, когда весь фермент перейдет в комплекс ES, т.е. когда все активные центры насыщены субстратом и дальнейшее увеличение концентрации субстрата не приведет к увеличению скорости реакции.

Преобразуя представленное выше уравнение, получим выражение, которое будет иметь следующий вид:

V₀=

Vmax[S]

K s+[S]

 

Это уравнение названо уравнением Михаэлиса-Ментен. Оно имеет огромное значение для выражения зависимости действия ферментов от концентрации субстрата. Однако оно содержит и ряд недостатков, в частности, при его выводе было сделано несколько допущений, например, не учитывалась вторая стадия ферментативной реакции - образование E и P.

В связи с этим был предложен рад усовершенствованных уравнений, с учетом влияния образовавшихся продуктов реакции. В настоящее время наиболее широко используют уравнение Холдейна-Бриггса. Оно имеет следующий вид:

V₀=

Vmax[S]

K m+[S]

 

В этом уравнении вместо K _s - константы диссоциации комплекса ES, который присутствует в уравнении Михаэлиса-Ментен, стоит K_m-константа Михаэлиса (в числителе которой находятся константы скоростей реакций, ведущих к распаду комплекса ES в двух направлениях):

K_m=

k-1+K+2

K +1

 

Поскольку K _s =

k-1

k+1

,то K_m = K_s+

k+2

k+1

, то есть K_m всегда больше K_s.

Для того, чтобы графическая зависимость, выражающая влияние концентрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции, из гиперболической преобразовалась в прямолинейную, что, очевидно, представляет большее удобство в экспериментальной практике, уравнение Холдейна-Бриггса было преобразовано Лайнуивером и Берком по методу двойных обратных величин.

V0

=

K m

Vmax

·

[S]

+

Vmax

 

Графически это выгладит так:

Рис. 8.4. Влияние концентрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции (а - по методу Михаэлиса-Ментен, б - по методу Лайнуивера-Берка)

Величина K_m - это ключевой кинетический параметр; если [S] = K _m, то V= V_max/2, следовательно, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (в молях на литр), при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Приблизительное значение K_m можно получить простым графическим способом, как это показано на рис. 8.4 а; однако в этом способе достаточно велика погрешность в нахождении V_max. Значительно удобнее пользоваться прямолинейной зависимостью при обработке данных по методу двойных обратных величин, рис. 8.4 б. В этом случае можно получить более точное значение K_m.

Таблица 8.1. Значение констант Михаэлиса - К (мМ/л) для некоторых ферментов

Фермент	Субстрат	К
Каталаза	H2 O 2	25,0
Гексокиназа	АТФ	0,4
	Глюкоза	0,05
	Фруктоза	1,5
Химотрипсин	Глицил-тирозинил-глицин	10,8
	N-бензол-тирозин-амид	2,5
P - Галактозидаза	Лактоза	4,0

Источником множества недоразумений как в прошлом, так и в настоящем, является некорректное использование термина "константа Михаэлиса" и двух символов K_s и K_m для обозначения величин отнюдь неидентичных, несмотря на совершенно четкие рекомендации Комиссии по ферментам Международного Биохимического Союза. Первая величина -K_s- константа равновесия, выражаемая отношением K_s =

k-1

k+1

,

характеризует сродство фермента к субстрату (или, иначе, прочность комплекса ES), причем существует обратная пропорциональность между величиной K_s и сродством фермента к субстрату. Вторая величина -K_m-соответствует концентрации субстрата, при которой V= V_max/ 2. Часто свойство K_s ошибочно приписывают K_m. Ha самом деле K_m будет являться мерой сродства фермента к субстрату только в том единственном случае, когда величина k₊₂ будет настолько мала, что K_m практически совпадет с K_s.

Многие ферменты катализируют реакции с участием двух субстратов. К так называемым бимолекулярным реакциям относятся реакции переноса химических группировок с одного соединения на другое, реакции синтеза, окислительно-восстановительные реакции.

Такие реакции могут протекать по двум различным механизмам. В реакциях первого типа, называемых реакциями единичного замещения, два субстрата А и В образуют с ферментом комплекс EAB, который затем распадается с образованием продуктов реакции С и Д. Второй тип двухсубстратных реакций протекает по механизму двойного замещения (механизм типа "пинг-понг"). В этих реакциях с активным центром фермента в каждый момент времени связан только один из двух субстратов.

При исследовании кинетики бимолекулярных реакций концентрацию одного из субстратов оставляют постоянной (В), а второго - изменяют (А). В этом случае в координатах 1/V от 1/[A] можно получить "кажущееся" значение К _т. Истинное значение V_max и К ^B_m получают при исследовании нескольких концентраций субстрата В. Точно так же поступают при определении K ^A_m (когда концентрация А постоянна, а концентрация В варьируется). К_т по отношению к различным субстратам в одной и той же реакции могут быть различными - это хорошо видно из следующего примера.

Реакция катализируемая алкогольдегидрогеназой:

CH₃CH₂OH + НАД⁺ ↔ CH₃COH + НАДН + H⁺

этанол уксусный альдегид

Значение К_т для алкогольдегидрогеназы дрожжей:

Субстрат	Кт, М/л
НАД+	1,0 ×10-4
CH3CH2OH	2,4 ×10-2
НАДН + H+	3,5 ×10-5
CH3COH	1,0 ×10-4