Количественное определение билирубина по методу Йендрашека

Гемохромогенные пигменты (билирубин) образуются в клетках РЭС при распаде гемопротеидов (гемоглобина, миоглобина, цитохромов). Получившееся соединение является амфифилом, плохо растворимо в воде и поэтому по крови транспортируется в комплексе с альбумином (свободный билирубин). В таком виде билирубин не реагирует с диазореактивом, поэтому его называют ещё непрямым. Комплекс «альбумин-билирубин» доставляется с током крови в печень, где билирубин преобразуется с помощью уридиндифосфоглюкуроновой кислоты (УДФГК) в растворимый конъюгат «билирубин-глюкуронид» (он даёт прямую реакцию с диазореактивом) – прямой (связанный) билирубин. В норме в плазме крови на долю непрямого (свободного) билирубина приходится не менее 75% всего содержания желчных пигментов, а вклад связанного (конъюгированного) не должен превышать 25%, а может отсутствовать.

Принцип метода: Способ основан на том, что прямой (связанный) билирубин даёт с диазореактивом (диазотированной сульфаниловой кислотой) розовое окрашивание, а непрямая (свободная) его форма окрашивается только после добавления кофеинового реактива. Норма содержания общего билирубина 8,6-20,5 мкмоль/л, связанного 0-5,1мкмоль /л, свободного до 16,5 мкмоль/л. Количество свободного билирубина вычисляется разностью общего и связанного билирубинов.

Избыток билирубина (гипербилирубинемия) в крови наблюдается при заболеваниях: инфекционных гепатитах, желчнокаменной болезни, панкреатите, серповидноклеточной анемии, алкоголизме, токсоплазмозе и т.д. Это приводит к развитию различных форм желтухи. При гемолитической желтухе регистрируют рост уровня свободного билирубина, а при печёночной повышаются величины обеих форм пигмента. Обтурационная желтуха характеризуется увеличением доли его связанной фракции. Разные паренхиматозные желтухи отличаются различными по направлению сдвигами, обусловленными действием разнообразных по природе токсинов. Гипобилирубинемия не встречается.

6. Количественное определение кальция в сыворотке крови

Кальций в сыворотке находится в виде солей, коллоидного и кальция, связанного с белками. Его общее содержание составляет 2,25-2,75 ммоль/л, уровень ионизированного кальция лежит в пределах 2,1-2,6 ммоль/л. Сыворотка крови, гепаринизированная плазма без следов гемолиза в течение 24 часов при t⁰ 15-25⁰С или 7 суток при t⁰ 2-8⁰С сохраняет концентрацию кальция. В моче уровень ионизированного кальцияв норме составляет 2,5 ммоль/л-6,2 ммоль/24ч. Пробы суточной мочи следует отбирать с добавлением 10 мл 6 моль/л HCl для предотвращения осаждения соли кальция.

Принцип метода: ионы кальция в щелочной среде вступают в реакцию с о-крезолфталеином, образуя окрашенный комплекс. Интенсивность фиолетовой окраски измеряется при длине волны 570-580 нм, что прямо пропорционально концентрации кальция в пробе и при t⁰ 20-25⁰С.

Реактивы:

─ 1-CALCIUM

─ 2- CALCIUM

Содержащие комплексон о-крезолфталеин (0.06 ммоль/л), 8-оксихинолин (8.6 ммоль/л), HCl (30 ммоль/л) и этаноламин (377 ммоль/л).

─ 3-STANDARD (2,5 ммоль/л).

Вначале готовят рабочий реагент. Для этого осторожно перемешивают реагенты 1-CALCIUM и 2- CALCIUM в соотношении 4+1. Затем в три пробирки: 1-ая холостая проба, 2-ая исследуемая проба (ИП), 3-я стандартная проба (СП) приливают по 1000мкл рабочего реагента. Подогревают каждую пробу до температуры определения, а затем добавляют во 2-ую пробу 10 мкл сыворотки, в 3-ю – 10 мкл стандарта. Тщательно перемешивают и через 10 минут считают абсорбцию исследуемой пробы А(ИП) и стандартной пробы А(СП) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение 30 минут.

Расчёт результатов:

Концентрация кальция = А(ИП)/А(СП) х концентрация стандарта.

Гиперкальциемия характерна при гиперфункции паращитовидных желез, при повреждении костей, опухолях, вырабатывающих паратгормон, избыточном потреблении витамина Д, различных злокачественных опухолях, саркоидозе, молочно-щелочном синдроме, акромегалии, «идиопатической» гиперкальциемии у детей, дегидратации (например, при рвоте, поносе, приёме алкоголя), ятрогенной гиперкальциемии и т.д.

Гипокальциемия развивается при гипофункции паращитовидных желез, тяжёлом рахите, беременности, тетании, дефеците магния, после переливания крови, после больших травм, ожогов, панкреатите.