Определение концентрации глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Метод специфичен и точен, дает возможность определять только “истинную” глюкозу, поэтому предложен в качестве универсального для всех клиник нашей страны. Согласно этому способу, содержание глюкозы в крови натощак составляет 3,3-5,5 ммоль/л.

Принцип метода. В его основе лежат следующие реакции:

Глюкоза + Н₂О + О₂ Глюконат + Н₂О₂;

глюкозооксидаза

2 Н₂О₂ + фенол + 4-аминоантипирин 4-(n-бензохиноно-

пероксидаза

моноимино)-феназон + 4 Н₂О.

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием пероксида водорода, при разрушении которого под влиянием пероксидазы происходит конденсация фенола и 4-аминоантипирина в окрашенное соединение 4-(n-бензохинономоноимино)-феназон. Количество последнего прямо пропорционально содержанию глюкозы в пробе.

Реактивы. Рабочий реактив, готовый к использованию, содержит фосфатный буфер (250 ммоль/л, рН 7), фенол (5 ммоль/л), 4-аминоантипирин (500 мкмоль/л), глюкозооксидазу (более 250 мккат/л), пероксидазу (более 50 мккат/л). Образцы, которые не исследуются сразу же по получению, необходимо хранить в пробирках, содержащих фторид, либо йодацетат натрия. Последние тормозят гликолиз и стабилизируют уровень глюкозы.

Ход определения

В 3 инкубационные кюветы с длиной оптического пути 1 см внесите по 1 мл рабочего реагента, подогрейте до 37°С в течение 5 мин, добавьте во вторую и третью соответственно по 10 мкл стандартного раствора глюкозы и образца (serum или плазму), тщательно перемешайте, инкубируйте 5 мин и измерьте при λ=500 нм абсорбцию стандарта и образца относительно бланка (холостой пробы в первой кювете). Вычислите концентрацию глюкозы по следующей формуле: С_оп = С _ст · Е _оп / Е_ст = ммоль/л, где - С_ст - концентрация стандартного раствора глюкозы; Е_оп - оптическая плотность опытного раствора; Е_ст - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы. Линейность метода - до 22 ммоль/л, при необходимости образец разведите в физрастворе и результат умножьте на коэффициент разбавления.

Контроль выполнения лабораторной работы

1. К какому классу ферментов относится глюкозооксидаза?

2. Каково в норме содержание глюкозы в моче?

3. Предположительно при патологии каких эндокринных образований меняется концентрация глюкозы в крови?

4. Каков почечный порог для глюкозы?

5. Принцип глюкозооксидазного метода определения уровня глюкозы в биологических жидкостях.

Темы рефератов:

1. Роль углеводов в питании человека.

2. Судьба гликогена в печени и мышцах.

3. Особенности переваривания и всасывания углеводов у грудных детей.