Построение градуировочной (калибровочной) кривой

Для того, чтобы по величине оптической плотности данного раствора найти его концентрацию, необходимо построить калибровочную кривую, которая показывает зависимость оптической плотности раствора от количества вещества. Для построения градуировочной кривой готовят ряд растворов с известным содержанием вещества (для этого берут разные количества стандартного раствора). Измеряют оптические плотности всех растворов и строят кривую, откладывая по оси абсцисс известные концентрации, а по оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности.

По градуировочной кривой определяют концентрацию вещества в исследуемом растворе. Для этого готовят раствор определяемого вещества по той же методике, по которой готовились стандартные растворы для построения калибровочной кривой. Необходимо точно соблюдать количество и порядок прибавления реактивов. Раствор готовится в мерной колбе того же объема. Измерения на приборе проводятся через такой же промежуток времени после приготовления окрашенного раствора, как измерения при построении калибровочной кривой. В некоторых случаях (например, при определении аммиака с помощью реактива Несслера) необходимо точно по часам отсчитывать время, прошедшее после приготовления окрашенного раствора. Раствор наливают в ту же кювету, для которой построена калибровочная кривая, и включив тот же светофильтр, определяют оптическую плотность раствора. Затем по ней находят концентрацию определяемого вещества, соответствующую данной оптической плотности. Градуировочную кривую часто проверяют.

При проведении цветных реакций и построении калибровочных кривых необходимо помнить следующее:

1. Измерение поглощения следует проводить в дополнительной для цветной реакции области спектра. Так, если при реакции раствор окрашивается в желтый цвет, нужно измерять поглощение этим раствором синего света, т.е. выбрать необходимую длину волны или соответствующий светофильтр.

2. Исследовать цветную реакцию лучше всего в максимуме поглощения – этим достигается наибольшая чувствительность. Если положение максимума неизвестно, его следует определить. Такие предосторожности гарантируют получение хороших результатов даже на малочувствительном приборе.

3. В кювете с контрольным раствором обязательно должны содержаться все компоненты, кроме исследуемого вещества.

4. Контрольный раствор должен быть приготовлен очень тщательно, поскольку от этого зависит получение правильных результатов.

5. Если зависимость линейна, для получения хорошей градуировочной кривой нужно не менее пяти точек. Для нелинейной кривой их нужно существенно больше. Построение кривой позволяет исключить точки, поглощение для которых получено ошибочно.

6. Измерение концентрации необходимо проводить минимум трижды и на кривую наносить все значения, а не их среднюю величину. Такой способ построения наглядно показывает точность определения концентрации по полученной градуировочной кривой. Кроме того,+ он позволяет сразу обнаружить неправильные измерения по их сильному отклонению от кривой. На рисунке показаны этапы построения калибровочной кривой.

7. Калибровочные кривые, полученные с реагентами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реагента градуировочную кривую надо получить заново.

8. Наилучшая кривая, проведенная по всем экспериментальным точкам, не обязательно должна проходить через нуль. Это связано с тем, что для поглощающего контрольного раствора практически невозможно получить точно такое же соотношение всех компонентов, как для образца.

Фотоэлектроколориметрия

Фотоэлектроколориметрия – определение концентрации вещества в растворе по изменению силы тока в фотоэлементе при падении на него луча света, прошедшего через исследуемый раствор (прозрачный, окрашенный). Многие соединения, слабо поглощающие в видимой области, после реакции с другими веществами дают окрашенные продукты, количество которых однозначно связано с концентрацией исходного вещества. Такую цветную реакцию используют для обнаружения этих веществ.

При некоторых стандартных условиях и определенных концентрациях вещества проводят реакцию, а затем измеряют поглощение раствора. В качестве сравнения используют ту же смесь, но без исследуемого вещества. При прохождении светового потока через окрашенную прозрачную жидкость часть света поглощается. Степень поглощения света, или коэффициент экстинкции, во многих случаях прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора. Окраска раствора зависит от концентрации в нем растворенного вещества:чем выше концентрация, тем интенсивнее окраска и тем больше света поглощает раствор. Степень светопоглощения определяют в приборе – фотоэлектроколориметре (ФЭК) – путем уравнивания интенсивности света, прошедшего через исследуемый окрашенный раствор, и света, прошедшего через контрольный раствор. Необходимо подчеркнуть. Что на ФЭКах можно исследовать только окрашенные растворы, т.к. источником света является лампа накаливания, поэтому приборы этого класса могут работать только в видимой части электромагнитного спектра. Современные фотометры позволяют работать и в УФ-области, так как имеют два источника излучения (накаливания и ртутно-кварцевую лампы), но в отличие от спектрофотометров, вместо монохроматора в фотометрах используют набор светофильтров (светофильтр выделяет из всего спектра источника света излучение определенного диапазона длин волн).

Приготовление контрольного раствора весьма важная составляющая всех оптических методов исследования, т.к. при использовании любых оптических методов обязательно готовят контрольные растворы. В контрольный раствор добавляются все реактивы, что и в исследуемый образец, кроме определяемого вещества. При его приготовлении соблюдаются все особенности (последовательность добавления реактивов, время выдержки и т.д.), что и при приготовлении исследуемого образца. По степени светопоглощения определяют концентрацию вещества в растворе.

а) Biophotometer (Eppendorf) - компактный анализатор для определения нативной и денатурированной ДНК, РНК, олигонуклеотидов, белка по оптической плотности методами Лоури и Брандфорда, плотности суспензий бактериальных клеток. Автоматическое определение концентрации компонента в пробе; спектральный диапазон от 220 до 750 нм, фильтры 230, 260, 280, 320, 562, 595 нм; может быть укомплектован принтером.

б) Униплан (Пикон) – планшетный фотометр (используется для работы с плашками, для обработки результатов иммуноферментного анализа) два фильтра в комплекте, остальные поставляются по желанию заказчика; жидкокристаллический дисплей, работа в режиме диалога, возможность набора формулы расчета с последующим сохранением заданных параметров, запоминание калибровочной кривой.

С пектрофотометрия

Спектрофотометрия – определение количества вещества в растворе или твердой среде по измерению светопоглощения волн строго определенной длины. Светопоглощение измеряют с помощью фотоэлемента по изменению силы тока, возникающего в нем, при падении на фотоэлемент светового потока, прошедшего через контрольный, а затем через исследуемые растворы или образцы. Измерение светопоглощения производится в приборе спектрофотометре, кварцевая призма которого выявляет монохроматические пучки спектра, соответствующие максимуму поглощения исследуемого вещества. Поэтому приборы данного класса имеют больший спектр возможностей, чем фотометры. В качестве примера технических возможностей спектрофотометров приведены краткие технические характеристики СФ-56А (ЛОМО, Россия).

СФ-56А Диапазон от 190 до 1100 нм; однолучевой сканирующий; шаг сканирования 5 нм, обзорное сканирование и вывод заданных участков спектра на монитор; автоматическое однократное и многократное выполнение измерений для одного или нескольких образцов на заданных оператором длинах волн с заданным временным интервалом между циклами измерений; математическая обработка результатов измерений, вычисление оптической плотности, концентрации, а также расчет цветовых характеристик исследуемых объектов.