Денатурация и ренатурация ДНК

Нуклеопротеины

Нуклеопротеины – сложные белки, которые состоят из белковой части и небелковой части – простетической группы, которая представлена нуклеиновыми кислотами. Существует 2 типа нуклеопротеинов, которые отличаются по составу, размеру и физико-химическим свойствам: дезоксирибонуклеопротеины (простетическая группа ДНК) и рибонуклеопротеины (простетическая группа РНК). Дезоксирибонуклеопротеины преимущественно локализованы в ядре клеток и в митохондриях. Рибонуклеопротеины – в цитоплазме, ядре и ядрышках.

Функция ДНК состоит в хранении генетической информации, РНК – передаче наследственной информации.

Белковая часть нуклеопротеинов представлена гистонами и негистоновыми белками. Различают 5 классов гистонов (Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4), которые различаются по размерам, аминокислотному составу и заряду. Гистоновые белки имеют положительный заряд, который обусловлен наличием положительно заряженных аминокислот – аргинина и лизина. Негистоновые белки представлены сложными белками-ферментами, а также регуляторными белками и являются кислыми, т.е. имеют отрицательный заряд.

Виды и функции ДНК

Основные функции ДНК по А. Ленинджеpу: 1) хpанение запаса генетической инфоpмации, необходимой для кодиpования стpуктуpы всех белков и всех РНК каждого вида оpганизма; 2) pегуляция во вpемени и пpостpанстве биосинтеза компонентов клеток и тканей; 3) опpеделение деятельности оpганизма в течение его жизненного цикла; 4) обеспечение индивидуальности данного оpганизма.

Различают следующие основные виды ДНК: 1) ядерные (хромосомные) ДНК; 2) ДНК плазмид; 3) ДНК хлоропластов; 4) ДНК митохондрий; 5) ДНК вирусов.

Ядерная ДНК локализована в ядре эукариотической клетки. Аналогом ядерной ДНК у бактерий служит генофор, или нуклеоид, который представляет собой кольцевидно замкнутую ДНК, не отделенную от цитоплазмы мембраной. Нередко генофор называют бактериальной хромосомой.

Молекулы ядерных ДНК содержат основной объем информации обо всех наследственных признаках организма. Их функция – хранение этой информации, обеспечение ее экспрессии и рекомбинации, а также воспроизводство при делении клетки и передача последующим поколениям организма.

Нуклеотиды в нуклеиновых кислотах связаны 3′,5′-фосфодиэфирной связью, которая возникает между 3′-ОН группой углевода одного нуклеотида и 5′-ОН группой углевода другого нуклеотида (рис. 9.1)..

РНК – одноцепочечная молекула. Однако при наличии в цепи РНК участков с комплементарной последовательностью единичная цепь РНК способна сворачиваться с образованием так называемых «шпилек», структур, имеющих двуспиральные характеристики

Рис. 9.1. Первичная структура нуклеиновых кислот

Для понимания ряда особенностей вторичной структуры ДНК важное значение имеют закономерности количественного содержания азотистых оснований, установленные впервые Э.Чаргаффом в 1949 году и названные правилами Чаргаффа:

1. Количество пуриновых оснований равно количеству пиримидиновых оснований

А + Г = Ц + Т или

2. Количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина:

А + Ц = Г + Т или

3. Количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина равно количеству цитозина:

А = Т и Г = Ц; соответственно

4. Коэффициент специфичности, который отражает для эукариот этот коэффициент ниже единицы (0,54 – 0,94), для прокариот – выше единицы.

В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф.Крика, предложенной в 1953 г. на основании ряда аналитических данных, а также рентгеноструктурного анализа, молекула ДНК состоит из 2-х цепей, образуя правовращающую спираль, в которой обе полинуклеотидные цепи закручены вокруг одной и той же оси. Удерживаются полинуклеотидные цепи водородными связями, образующимися между комплементарными азотистыми основаниями: между А и Т – две водородные связи, Ц и Г – три водородные связи.

Азотистые основания расположены внутри спирали, а фосфорные остатки и углеводные компоненты – снаружи. Кроме водородных связей в стабилизации молекулы ДНК принимают участие силы гидрофобного («стэкинг») взаимодействия, образующегося между плоскостями оснований внутри двойной спирали ДНК (рис. 9.2).

Обе цепи в молекуле ДНК имеют противоположную полярность (антипараллельны). Это означает, что одна цепь имеет направление 5'→ 3', а другая 3'→5'. Подобная направленность цепей играет важную биологическую роль при репликации и транскрипции молекулы ДНК.

Рис.9.2. Двойная спираль ДНК

Конфигурация двойной спирали ДНК меняется в зависимости от количественного содержания в ней воды и ионной силы окружающей среды. В настоящее время известно шесть форм ДНК (от А до Е и Z-форма). При физиологических условиях доминирующим структурным типом ДНК является В-форма. Расстояние между витками спирали (или шаг спирали) равно 3,4 нм. На этом участке укладывается 10 нуклеотидных остатков, размер одного нуклеотида составляет 0,34 нм, диаметр биспиральной молекулы 1,8 нм. В молекуле ДНК встречаются последовательности, которые называются палиндромами. Палиндром – это слово, фраза или предложение, которые читаются одинаково слева направо и справа налево. Например, «ротатор», «я иду с мечем судия». Этот термин используется к области ДНК с обратимой последовательностью нуклеотидов, имеющих двойную симметрию внутри двухцепочечной ДНК. Такие последовательности комплементарны сами себе внутри каждой цепи и поэтому в этих местах могут образовываться шпильки или крестообразные структуры.

Крестообразная структура

Среди разнообразных конформаций ДНК различают линейную ДНК и кольцевидно замкнутую ДНК. Кольцевидная структура ДНК характерна для бактерий и некоторых вирусов.

Третичная структура ДНК: ДНК в клетке имеет длину 1,74 м, поэтому понятно, что в ядре происходит упаковка ДНК. Третичная структура ДНК прокариот может образовываться в результате дополнительного скручивания в пространстве двуспиральной молекулы с образованием суперспирали или суперкольца.

У высших организмов ДНК находится в хромосомах, которые при митозе видны в световой микроскоп. В каждой хромосоме находится молекула ДНК, которая составляет основу хроматина. Хроматин – комплекс ДНК с РНК и белками (ДНК 30-45%, гистоны 30-50%, негистоновые белки 4-30%, РНК до 10%). Структурная организация хроматина такова, что позволяет использовать одну и ту же генетическую информацию ДНК по-разному в специализированных клетках. При этом основная часть хроматина не активна. Активный хроматин составляет в разных клетках от 2 до 11%. Различают несколько уровней укладки (компактизации) ДНК.

1. Нуклеосомы. В электронном микроскопе изображение хроматина напоминает бусы: шаровидные утолщения размером около 10 нм, разделенные перемычками. Каждая нуклеосома содержит отрезок двуспиральной ДНК, равный по протяженности примерно 145-150 парам оснований, обернутый в 1,5 оборота вокруг ядра, состоящего из гистонов (2 Н2А, 2 Н2В, 2 Н3 и 2 Н4). Свободные от контакта с белками участки ДНК называют линкерными (или связующими). Их длина варьирует в зависимости от типа клеток (от 15 до 100 нм). Линкерные участки ДНК либо свободны, либо контактируют с гистонами Н1. Степень компактизации в 5 раз. Примерно 90% ДНК входит в состав нуклеосом, 10% содержится в перемычках между нуклеосомами. Считают, что нуклеосомы содержат фрагменты «молчащего» хроматина, а перемычки – активного. При развертывании весь хроматин активный.

М ежнуклеосомный разрыв ДНК - способ запрограммированной гибели клеток – апоптоз.

Из нуклеосом образуются фибриллы (рис. 9.3).

Рис. 9.3. Нуклеосомы

2. Фибриллы толщиной 10 нм состоят из ряда нуклеосом, касающихся друг друга своими краями и ориентированных плоскими поверхностями вдоль оси фибриллы. Эта структура называется соленоид. Компактизация в 40 раз.

3. Фибриллы скручиваются в спираль, на виток которых приходится 6-7 нуклеосом. Этому способствуют гистоны Н1, которые сближают соседние нуклеосомы, формируя регулярную структуру. В результате образуется хроматиновое волокно диаметром 30 нм.

4. Для того, чтобы образовалась митотическая хромосома нормального размера, волокно диаметром 30 нм должно подвергнуться дополнительной компактизации с результирующим уменьшением длины еще в 100 раз. В этом процессе участвуют ДНК-связывающие белки.

Транскрипционно-неактивный хроматин (гетерохроматин) плотно упакован и поэтому соответствующие области интенсивно окрашиваются. Участки транскрипционно-активного хроматина (эухроматина) имеют более слабую окраску.

Денатурация и ренатурация ДНК

Двухцепочечные стpуктуpы ДНК пpи нагpевании, экстpемальных значениях pН, обpаботке мочевиной и дp. могут пеpеходить в фоpму неупоpядоченных клубков - денатуpация ДНК. Раствоp нативной ДНК пpи 260 нм имеет оптическую плотность на 40% ниже оптической плотности смеси нуклеотидов или отдельных цепей ДНК. Это явление называют гипеpхpомным эффектом. Поэтому о денатуpации ДНК судят по увеличению поглощения ультрафиолета при 260 нм. Гиперхромный эффект проявляется в узком диапазоне темпеpатуp - точка плавления (80-85 ºС). Денатуpация обpатима, если остались спиpализованные участки ДНК. Восстановление стpуктуpы ДНК после удаления денатуpирующего фактоpа (за счет комплементаpного спаpивания оснований нуклеотидов) называется ренатурацией (pенативация ДНК, отжиг ДНК). На явлении денатуpации-pенативации основан метод гибpидизации. Известны гибpидные двухцепочечные молекулы: ДНК-РНК, обpазуются как пpомежуточные фоpмы пpи действии обpатной тpанскpиптазы; ДНК-РНК на коpоткое вpемя в пpоцессе тpанскpипции ДНК. В процессе трансляции и транскрипции происходит разделение цепей ДНК.

Виды и функции РНК

Все типы РНК пpедназначены для снятия инфоpмации о стpуктуpе белка с ДНК и обеспечения биосинтеза белка в соответствии с этой инфоpмацией. РНК является одиночной полинуклеотидной цепью, постpоенной из четыpех основных типов pибонуклеотидов - АМФ, ГМФ, ЦМФ и УМФ. Для РНК хаpактеpны миноpные нуклеотиды с необычными азотистыми основаниями - дигидpоуpацил, 3-метилуpацил, 1-метилгуанин и дp. (до 50 типов). Особенно их много в аминоацил-т-РНК (до 10% от всех нуклеотидов). В РНК содеpжание аденина и гуанина не соответствует содеpжанию уpацила и цитозина.

Различают следующие типы РНК:

1. Матричная, или инфоpмационная, РНК (м- или и-РНК), м.м. 25000-1000000 Да, состоит из 75-300 нуклеотидов, синтезиpуется в ядpе из пpе-м-РНК; составляет 5-7% от всей клеточной РНК. Период полужизни несколько минут. На 5′-конце всех эукариотических мРНК имеется особая структура, называемая кэпом. Кэп представляет собой 7-метилгуанозинтрифосфат. Образование кэпа происходит ферментативным путем в ядре еще до завершения транскрипции. Считается, что кэп, с одной стороны, предохраняет 5′-конец мРНК от ее расщепления 5′-экзонуклеазами, с другой стороны, используется для специфического узнавания в системе трансляции. За кэпом следует нетранслируемый участок (от 3-15 нуклеотидов до инициирующего кодона), в котором располагается последовательность нуклеотидов, комплементарная последовательности рРНК. Ее роль – обеспечение правильного взаимодействия 5′-конца с рибосомой. Завершается транслируемый участок терминирующим кодоном, за которым часто следует гексануклеотид ААУААА. У большинства мРНК 3′-конец содержит полиаденилатную цепочку из 20-250 адениловых нуклеотидов, не являющуюся результатом транскрипции, а присоединяющуюся ферментативным путем к мРНК в ходе ее созревания в ядре. Предполагается, что полиаденилатная последовательность отвечает за поддержание внутриклеточной стабильности мРНК, определяет ее время существования. Кодовым элементом является тpиплет нуклеотидов (кодон), кодиpующий аминокислоту. Во втоpичной стpуктуpе - изогнутая цепь; по некоторым данным в тpетичной структуре полинуклеотидная цепь связана (намотана) с тpанспоpтным белком инфоpмофеpом.

2. Транспортные РНК (тРНК) – около 15%. Транспортные РНК обладают небольшой молекулярной массой (~ 25 000) и содержатся в растворимой фракции цитоплазмы, выполняя функцию переноса аминокислот к месту синтеза белка – рибосоме. Первичные структуры тРНК содержат около 75 нуклеотидов. В клетке насчитывается не менее 20 видов молекул тРНК. Каждый или несколько видов тРНК соответствуют одной из 20 аминокислот, необходимых для биосинтеза белка. Вторичная структура всех тРНК напоминает «клеверный лист » и имеет 2 основных участка:

1. Акцепторный участок имеет на 3' конце последовательность нуклеотидов ЦЦА. К 3'-гидроксильной группе рибозы аденозильного остатка происходит присоединение карбоксильной группы аминокислоты. Транспортные РНК, соединенные с аминокислотами, называют аминоацил-тРНК (аатРНК). Они выполняют адаптерную функцию при переводе трехбуквенного кода нуклеиновых кислот в 20-буквенную последовательность аминокислот в полипептидной цепи (всего 61 аминоацил-тРНК).

2. Антикодоновая петля содержит специфический для каждой тРНК триплет нуклеотидов (антикодон) и служит для спаривания с соответствующим кодоном мРНК.

Третичная структура представлена пространственной структурой в виде локтевого сгиба (L-форма).

3. Рибосомные РНК (рРНК) – 80-85%, имеют разную и значительно большую молекулярную массу (35000-1000000, что соответствует 100-3100 нуклеотидам), являются структурными компонентами рибосом. Вторичная структура представлена спиральными участками, соединенными изогнутой одиночной цепью. Третичная структура рРНК – скелет рибосомы, имеет форму палочки или клубка; снаружи находятся рибосомальные белки.

Рибосомы обеспечивают специфический контакт мРНК и тРНК, в результате которого и происходит трансляция нуклеотидной последовательности, считанной с определенного гена, в аминокислотную последовательность соответствующего белка. Рибосомы млекопитающих состоят из 2-х нуклеопротеиновых субъединиц – большой с константой седиментацией 60S и малой – 40S (у прокариот – соответственно 50S и 30S). 60S-субъединица содержит 5S-рибосомную РНК (рРНК), 5,8S-рРНК и 28S-рРНК. Малая, 40S-убъединица включает единственную 18S-рРНК и около 30 полипептидных цепей. Все рибосомные РНК, за исключением 5S-РНК, имеют общего предшественника – 45S-РНК, локализованную в ядрышке. В ядрышке происходит упаковка высокометилированных рибосомных РНК с рибосомными белками.

4. Гетерогенные ядерные РНК (предшественник цитоплазматической мРНК), которые являются первичными транскриптами, образуются в эукариотических клетках, подвергаются процессингу в ядре. В результате образуются зрелые мРНК, которые поступают в цитоплазму и служат матрицей для биосинтеза белка. Молекулярная масса 10⁷.

5. Малые ядерные РНК (мя) РНК, которые непосредственно не участвуют в синтезе белка, но могут оказывать влияние на процессинг РНК, в частности на этапе вырезания неинформационных участков пре-мРНК.

Единица измерения 1 kb – это 1000 пар оснований двойной спирали ДНК или 1000 оснований одиночной полинуклеотидной цепи. 1 kb двойной спирали ДНК имеет длину 0,34 мкм и массу около 660 кДа.

9.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)– это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей (Kary Mullis; США, патент 4683202). Их амплификация (иногда в миллионы раз) осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы:

– два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим (ограничивающим) отрезок последовательности-мишени; 3'-гидроксильные группы праймеров после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу (таким образом, отмечаются начальный и конечный участки нужного фрагмента на ДНК-матрице);

– ДНК-мишень длиной от 100 до 35000 п.н.;

– термостабильная ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерий Thermus aquaticus, которая не теряет своей активности при температере
95°С и выше;

– четыре дезоксирибонуклеотида;

– буфер, содержащий ионы магния.

Этапы ПЦР:

1. Денатурация (плавление). Для денатурации ДНК (расхождение цепей) ее выдерживают до 1 мин. при 95°С. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза и четыре типа дезоксирибонуклеотидов.

2. Ренатурация (отжиг). Температуру смеси медленно понижают до 55°С, при этом праймеры спариваются с комплементарными последовательностями ДНК.

3. Синтез (элонгация). Температуру повышают до 75°С, т.е. температурного оптимума для ДНК-полимеразы Taq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемой 3'-гидроксильной группой праймера. Все реакции проводятся в регулируемом термостате с повторением циклов, продолжительностью 3–5 мин. Эти циклы повторяют до 30 раз.

Применение метода ПЦР:

– Идентификация патогенных микроорганизмов и вирусов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений. Для синтеза праймеров, специфичных в отношении исключительно ДНК-мишени, необходимо знать нуклеотидную последовательность ДНК предполагаемого патогенного микроорганизма. В этом случае в ходе ПЦР будет амплифицироваться только фрагмент ДНК, длина которого равна суммарной длине двух праймеров и фрагмента ДНК между ними.

– Получение кДНК (ДНК, комплементарные информационной РНК, мРНК). С помощью обратной транскриптазы на матрице мРНК синтезируется цепь кДНК. На матрице синтезированной цепи кДНК синтезируется вторая цепь и затем в последовательных циклах ПЦР с введением «внутренних праймеров» накапливаются значимые количества кДНК, комплементарной 3'-концу мРНК.

– Синтез генов с помощью ПЦР.

– Выделение делеций или вставок в генах, ответственных за то или иное наследственное заболевание. Образцы наносят на узкие полоски нитрата целлюлозы и обрабатывают мечеными олигонуклеотидами, содержащими нормальную или мутантную последовательность. Радиоавтографически оценивают, с какой из проб преимущественно связывается ДНК пациента.

- Исследование индивидуального паттерна (спектра, соотношения) генов при диагностике и контроле лечения опухолевых заболеваний и отборе тканей (органов) для трансплантации.

ДНК является носителем генов. Ген – единица наследственности, представляющая собой часть молекулы ДНК, кодирующей последовательность аминокислот одной полипептидной цепи. Экспрессией гена называют синтез белка или РНК по программе гена.

Существует 3 вида передачи наследственной информации (матричных синтезов): 1) ДНК ® ДНК – репликация; 2) ДНК ® РНК – транскрипция и 3) РНК ® белок – трансляция.

ДНК является макромолекулой, которая переносит генетическую информацию от поколения к поколению. Одна клетка млекопитающих содержит только несколько пикограммов (10^-12 г) ДНК.

Репликация

Репликация - процесс передачи генетической информации от ДНК к ДНК. Протекает в S-фазу клеточного цикла.

Репликация происходит полуконсервативным способом. Полуконсервативный способ означает, что цепи материнской молекулы ДНК расходятся и каждая служит матрицей для синтеза новой комплементарной последовательности. Две образовавшиеся двуспиральные молекулы ДНК, каждая из которых состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной комплементарной цепи, распределяются между двумя дочерними клетками. Таким образом, каждая из дочерних клеток получают информацию, идентичную той, которой обладала родительская клетка.

Механизм репликации. Механизм репликации у прокариот изучен лучше, чем у эукариот. Основные условия и компоненты репликации ДНК одинаковы у прокариот, таких как E.coli, и эукариот, включая человека. Основное функциональное значение процесса репликации ДНК заключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения генетической стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью.

9.4.1. Условия, необходимые для репликации:

1. Матрица, которой является неспаренная цепь ДНК.

2. Субстраты синтеза, которыми являются дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, ТТФ). Синтез идет по схеме: d(НМФ)n + dНТФ=d(НМФ)n+1 + PPн, где d(НМФ)n – ДНК до удлинения, d(НМФ)n+1 – ДНК после удлинения, dНТФ – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, РРн – пирофосфат. Нуклеозидтрифосфаты необходимы в качестве источника энергии, т.к. при расщеплении пирофосфата выделяется энергия для образования фосфодиэфирных связей.

3. Ферменты и белковые факторы, участвующие в синтезе ДНК:

1. ДНК-полимеразы I и III (у прокариот), которые участвуют в образовании 3',5'-фосфодиэфирных связей и обладают 3'®5' и 5'®3' экзонуклеазными активностями; ДНК-полимераза II является минорной ДНК-полимеразой, которая может участвовать в процессе репарации; ДНК-полимеразы IV и V, идентифицированные в 1999 г., участвуют в специфической репарации; у эукариот найдено пять типов ДНК-полимераз: α, ε, β, γ и δ.

2. DnaА-белок – узнает участок начала репликации.

3. DnaB-белок (хеликаза) – расплетает двойную спираль ДНК.

4. DnaС-белок – необходим для присоединения хеликазы к месту инициации синтеза.

5. Гистоноподобный белок – стимулирует инициацию.

6. ДНК-связывающий белок – стабилизирует расплетенные одноцепочечные участки ДНК и повышает активность хеликазы.

7. ДНК-гираза (топоизомераза II) вводит отрицательные супервитки в ДНК, выполняя функцию шарнира при продвижении репликационных вилок.

8. Праймаза (ДНК-зависимая РНК-полимераза, dnaG-белок) синтезирует РНК-затравку (праймер).

9. ДНК-лигаза - соединяет концы фрагментов ДНК.

10. Dam метилаза – метилирует (5’)УАТЦ последовательность в oriC.

Все ферменты и белковые факторы, участвующие в репликации, образуют макромолекулярный комплекс, называемый реплисомой.

Различают 3 стадии репликации: инициации, элонгации и терминации.

Стадия инициации

1. Репликация ДНК у E.coli начинается в области начала репликации, который называется oriC и состоит из 245 пар оснований.

2. Основным белком, участвующим в инициации является DnaА-белок.

3. dnaB-белки присоединяются к каждой цепи ДНК и действуют как хеликазы (helix - спираль), расплетая в обоих направлениях ДНК. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ.

3. Как только небольшой участок ДНК оказывается расплетенным, к каждой из разделившихся цепей прочно присоединяются несколько молекул ДНК-связывающего белка (SSB белок – single strand binding), которые препятствуют образованию комплементарных пар и обратному восстановлению цепей.

4. У прокариот хеликазе помогает фермент ДНК-гираза (семейство топоизомераз). Гираза выполняет функцию шарнира: он обеспечивает кратковременный разрыв одной из цепи ДНК, быстро восстанавливаемый с высокой точностью после одного или нескольких оборотов вокруг второй цепи. Этот фермент не только позволяет ДНК вращаться, но и активно закручивает ее в направлении, благоприятствующем расплетению цепей матрицы.

В результате расплетения молекулы ДНК образуется репликационный пузырь, который состоит из 2 репликативных вилок. Процесс репликации происходит в обеих репликативных вилках, но имеет противоположное направление, что обусловлено антипараллельностью двух полинкуклеотидных цепей ДНК.

5. В каждой репликативной вилке выделяют 3' и 5' концы. Синтез дочерних нитей ДНК происходит всегда в направлении 5'®3'. Стадия инициации завершается синтезом праймера - короткого фрагмента РНК, состоящего из 10-60 рибонуклеотидов, комплементарных одной из цепи матричной ДНК. Синтез праймера осуществляется ферментом ДНК-зависимой-РНК-полимеразой или праймазой. Синтез праймера необходим для фермента ДНК-полимеразы III, который не может начать синтез дочерней нити ДНК на "пустом" месте; 3′-ОН группа концевого рибонуклеотида праймера служит затравкой для синтеза ДНК под действием ДНК-полимеразы III.

Стадия элонгации

1. К 3’-ОН группе праймера присоединяется ДНК-полимераза III которая по принципу комплементарности синтезирует дочернюю цепь ДНК в направлении 5′®3′. Точность синтеза определяется тем, что феpмент ДНК-полимераза III катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание предыдущего нуклеотида комплементарно соответствующему основанию матрицы. Если не произошло образование водородных связей между присоединенным нуклеотидом и матрицей, фермент возвращается, вырезает неправильный нуклеотид с 3'-конца цепи за счет экзонуклеазной активности, после чего ДНК-полимеpаза продолжает присоединять правильные нуклеотиды в направлении 5'®3'. В pезультате достигается высокая точность матричного синтеза. У E.coli частота ошибок составляет 1 на 10⁹-10¹⁰ присоединенных нуклеотидов. Хромосомы E.coli содержат 4,6 × 10⁶ пар нуклеотидов. Следовательно, частота ошибок составляет 1 на 1 000 – 10 000 репликаций.

Если направление синтеза дочерней цепи ДНК и направление движения репликативной вилки совпадают, то цепь синтезируется непрерывно и называется лидирующей. Если направление синтеза ДНК и движение репликативной вилки не совпадают – цепь синтезируется фрагментами и называется запаздывающей. Фрагменты, синтезиpованные в запаздывающей цепи, называются фрагментами Рейджи Оказаки и состоят из 1000-2000 нуклеотидов у пpокаpиот и 100-200 нуклеотидов у эукариот.

2. После завеpшения синтеза фpагмента Оказаки РНК-затpавка (пpаймеp) удаляется нуклеотид за нуклеотидом с помощью 5'®3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеpазы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеpазной pеакции, осуществляемой ДНК-полимеpазой I (пpи этом в качестве затpавки используется 3'-конец пpедыдущего фpагмента Оказаки). Новый фрагмент Оказаки присоединяется к запаздывающей цепи ДНК с помощью феpмента ДНК-лигазы. Источником энергии для этой pеакции у эукаpиот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК.

Теpминация синтеза ДНК наступает вследствие исчеpпания матpицы. У хромосомы E.coli две репликативные вилки содержат область терминации, состоящий из копий 20 пар нуклеотидов и называемый Ter (ter minus). Репликационные пузыри сливаются, молекулы дочерней цепи ДНК сшиваются ДНК-лигазой и на каждой матpице обpазуется дочеpняя цепь ДНК.

Общие механизмы репликации у эукариот аналогичны таковым у прокариот. Как и у прокарит, репликация у эукариот происходит одновременно на обеих цепях. Единицей репликации у эукариот является репликон, размеры которого колеблются от 50 до 120 мкм. В клетках млекопитающих содержится от 10 000 до 100 000 репликонов. Эукариотические клетки содержат несколько типов ДНК-полимераз. В репликации ядерных хромосом участвует ДНК-полимераза α и ДНК-полимераза δ. Основным ферментом синтеза ДНК у эукариот является ДНК-полимераза δ.

Для репликации генома человека необходимо около 8 ч. Скорость репликации у E.coli составляет 1000 нуклеотидов в секунду. Репликация у эукариот происходит в 10 раз медленнее, чем у прокариот и составляет 100 пар оснований в секунду. Каждый репликон синтезируется приблизительно 1 час. Низкая скорость репликации у эукариот обусловлена, вероятно, формированием нуклеосом и наличием хромосомных белков.

Повреждения ДНК

При исследовании процессов повреждения ДНК в живой клетке следует учитывать, что ДНК в них связана с белками, в эукариотических клетках организована в виде нуклеосом с последующими уровнями компактизации до стадии хромосом. При нормальных значениях рН, температуры и давления в клетке возможны несколько типов повреждения ДНК.

1. Возможно гидролитическое отщепление аминогрупп от цитозина, аденина и гуанина с образованием урацила, гипоксантина и ксантина, соответственно. Наиболее часто происходит дезаминирование цитозина с образованием урацила: примерно 1000 на животную клетку в сутки (дезаминирование пуринов происходит в 50-100 раз реже). Дезаминирование цитозина выше на два порядка в одноцепочечной ДНК. Гидролиз N-гликозидных связей ведет к образованию свободных от оснований сайтов за счет отщепления пуриновых и пиримидиновых оснований. Пурины менее устойчивы к гидролизу – возможно до 10000 депуринизаций на животную клетку в сутки (депиримидинация в 20 раз реже). Апуриновые и апиримидиновые сайты не участвуют в матричных синтезах.

2. Оксидативные повреждения связаны с действием свободно-радикальных форм кислорода, синглетного кислорода и пероксидов. Оксидативные повреждения могут приводить к разрыву полинуклеотидной цепи за счет повреждения дезоксирибозы, разрыв конечных 3′5′-фосфодиэфирных связей, что нарушает присоединение следующего нуклеотида ДНК-полимеразой III. В настоящее время описано 40-60 различных типов повреждений азотистых оснований (насыщение двойных связей в циклических структурах, разрывы колец, присоединение новых групп к кольцам оснований и т.п.). Особенно мутагенным является 8-оксогуанин. Все эти изменения могут привести к серьезным нарушениям информационной роли полинуклеотидных цепей ДНК.

3. Метилирование ДНК в клетке происходит ферментативным и неферментативным путями. Малые молекулы (пептиды, полиамины и S-аденозилметионин способны к неферментативному метилированию с образованием 7-метилгуанина и 3-метиладенина. Если 7-метилгуанин нетоксичен, то 3-метиладенин способен блокировать репликацию. Считают, что в сутки может образовываться 600 остатков 3-метиладенина на человеческую клетку. Бактериальные и животные ферменты – метилтрансферазы обеспечивают метилирование цитозина с образованием 5-метилцитозина. Это основание в полинуклеотидой цепи является одним из маркеров для действия рестриктаз.

ДНК является мишенью для действия многих неблагоприятных факторов внешней среды.

1. Действие ультрафиолетовых лучей. Солнечный ультрафиолет подразделяют на три вида по длинам волн: УФ-А (длинноволновой), УФ-В (средневолновой) и УФ-С (коротковолновой). УФ-С абсорбируется в стратосфере озоновым слоем. У человека УФ-В может вызывать рак кожи. При действии ультрафиолета возможно образование тиминовых димеров (УФ-С или при хроническом действии УФ-В).

2. Ионизирующее излучение повреждает ДНК посредством образования свободных радикалов. Ионизирующее излучение способно вызывать «летальные» разрывы обеих цепей ДНК. Особенно опасны трансурановые элементы, альфа-частицы которых при тесном контакте с молекулами ДНК способны повреждать различные химические связи полинуклеотидных цепочек. Отметим, что максимальное влияние трансурановых элементов, загрязнивших территории после аварии на ЧАЭС, предсказывается через 25-40 лет.

3. ДНК является мишенью для эндогенных химических веществ и ксенобиотиков. К таким веществам относятся вещества, определяющие неферментативные превращения метаболитов «реактивные» молекулы, чаще всего обеспечивающие электрофильную атаку нуклеофильных центров в дуплексах ДНК. К неферментативным повреждающим ДНК веществам относят алкилирующие агенты (например, метил-метановые сульфонаты. Другим примером метаболической активации ДНК является повреждение бензапиреном, который является ароматическим углеводородом, поступающим в организм при курении и употреблении в пищу копченостей. В организме он гидроксилируется микросомальной монооксигеназной системой (цитохром Р-450) и превращается в продукт, повреждающий ДНК.

Повреждения ДНК выявляют с помощью эндо- и экзонуклеаз с последующим анализом нуклеотидных последовательностей образованных коротких полинуклеотидов автоматизированным секвенированием, методом иммунологического анализа, газовой хроматографией с масс-спектрометрией, полимеразной цепной реакции, методом капиллярного электрофореза с лазеро-индуцированной флуоресценцией.

Репаративный синтез ДНК

Как сказано выше, множество химических и физических агентов (ионизирующая радиация, УФО, алкилирующие агенты) вызывают в ДНК повреждения 4 основных типов.

1. Затрагивающие единичные нуклеотиды: депуринизация; дезаминирование цитозина до урацила; дезаминирование аденина до гипоксантина; алкилирование оснований; вставка или делеция нуклеотида; включение основания-аналога.

2. Затрагивающие пару нуклеотидов: УФ-индуцируемое образование тиминовых димеров; поперечные сшивки бифункциональным алкилирующим агентом.

3. Разрывы цепей: ионизирующая радиация; радиоактивная дезинтеграция каркаса ДНК.

4. Поперечные сшивки: между основаниями одной цепи или разных цепей; между ДНК и молекулами белка (например, гистонами).

Поврежденные участки могут быть подвергнуты репарации, замещены путем рекомбинации или остаться без изменений. В последнем случае возникают мутации, потенциально ведущие к гибели клетки.

Основной путь репарации включает 3 этапа:

1. Измененный участок ДНК распознается и удаляется при помощи ферментов ДНК-репарирующих эндонуклеаз.

2. ДНК-полимераза I связывается с 3′-концом поврежденной цепи ДНК и заполняет брешь, присоединяя нуклеотиды друг за другом комплементарно неповрежденной цепи ДНК.

3. ДНК-лигаза сшивает фрагменты ДНК и, тем самым, завершает восстановление структуры ДНК.

Системы pепаpации могут восстановить повpеждения ДНК только пpи наличии интактной комплементаpной цепи ДНК.

Транскрипция

Синтез РНК на матрице ДНК называется транскрипцией. Последовательность рибонуклеотидов в молекуле РНК комплементарна последовательности дезоксирибонуклеотидов одной из цепи ДНК. Та из двух цепей ДНК, по которой непосредственно идет транскрипция РНК-молекул, называется кодирующей цепью. Другую цепь называют некодирующей цепью соответствующего гена.

Единицей транскрипции является оперон (у прокариот) и транскриптон (у эукариот). По функциональному признаку в опероне выделяют регуляторные и структурные области:

1) промотор - место инициации транскрипции, к которому присоединяется фермент РНК-полимераза; в ДНК E. coli имеется 2000 промоторов на 4,8×10⁶пар оснований;

2) ген-оператор (или акцепторная зона у эукариот) - место связывания регуляторных белков, например, белка-репрессора;

3) структурные гены, включающие информативные участки - экзоны и неинформативные участки - интроны;

4) терминатор - последовательность нуклеотидов, сигнализирующая о завершении транскрипции.

РНК-полимераза должна найти и транскрибировать гены на протяженной молекуле ДНК. Для этого она находит промотор и связывается с ним. У бактерий функцию промотора выполняют две последовательности нуклеотидов на 5′-конце молекулы. Одна из них называется блок Прибнова (ТАТААТ), центр которого располагается в положении -10 (10 нуклеотидов на 5′-конце от первого транскрибируемого нуклеотида, обозначаемого +1). Другая последовательность, называемая -35 область, имеет последовательность ТТГАЦА. Это идеализированные последовательности, более характерные для промоторов клеток-прокариот. Первым транскрибируемым нуклеотидом является пуриновый нуклеотид.

Эукариотические гены, кодирующие белки, имеют блок Хогнесса (ТАТААА) в положении -25, а также ЦААТ-блок (ГГN ЦААТ ЦТ) в положении -75. Транскрипция у эукариот регулируется энхансерными (усиливающими) последовательностями, которые могут отстоять на несколько kb от стартового нуклеотида.

2. Промоторы отличаются по эффективности. Гены со строгими промоторами в клетке E. coli транскрибируются каждые 2 секунды, а транскрибирование генов со слабыми промоторами происходит один раз за 10 минут. Мутации в областях -1 или -35 подавляют активность промотора. Расстояние между этими областями оптимально в 17 нуклеотидов. Эффективность промоторов регулируется особенностями их нуклеотидного состава, а также регуляторными белками, связывающимися с ДНК рядом с областью промоторов.

3. Терминацию синтеза РНК вызывают длинные блоки АТ-последовательностей нуклеотидов в ДНК - терминатор (стоп-сигнал); у ряда прокариот обнаружен белок, называемый r-фактором, который в участке терминации освобождает РНК от матрицы ДНК.