Зависимость скорости реакции от температуры

 

А Б

Рис. 4. Зависимость скорости реакции от рН (А) и температуры (Б).

Скорость химической реакции повышается в 2 раза при повышении температуры на 10°С. Однако вследствие белковой природы фермента при дальнейшем повышении температуры наступает денатурация фермента. Температура, при которой скорость реакции максимальна, называется температурным оптимумом (рис. 4, Б). Для большинства ферментов оптимум температуры составляет 37-40°С. Некоторые ферменты термостабильны. Например, миокиназа мышц, которая выдерживает нагревание до 100°С.

Ключевое значение для широкого распространения метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в медицине и биологии имеет использование термостабильного фермента ДНК-полимеразы, полученной из термофильных бактерий.

Активаторы

Активаторы ферментов – это вещества 1) формирующие активный центр фер­мента (Co²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Са²⁺); 2) облегчающие образование фермент-суб­стратного комплекса (Мg²⁺); 3) восстанавливающие SH-группы (глутатион, цисте­ин, меркаптоэтанол); 4) стабилизирующие нативную структуру белка-фермента. Активируют ферментативные реакции обычно катионы (в таблице Менделеева с 19 по 30). Анионы менее активны, хотя ионы хлора и анионы некоторых других галогенов могут активировать пепсин, амилазу, аденилатциклазу. Активаторами могут быть белки: апопротеин А-I (лецитин-холестеролацилтрансфераза - ЛХАТ), апопротеин С-II (липопротеинлипаза - ЛПЛ), вторичные внутриклеточные посредники.

Ингибиторы

Ингибиторы ферментов – это соединения, которые взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции или прекращая ее.

Ингибиторы делят на две группы - неспецифические и специфические. Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию белка-фермента (соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи и др.) и их действие не связано с механизмами ферментативного катализа. Действие специфических ингибиторов связано с механизмами ферментативного катализа. Специфические ингибиторы делятся на 2 группы: необратимые и обратимые.

При необратимом ингибировании происходит непрерывная модификация молекул фермента, в результате чего фермент частично или полностью теряет свою активность. Такое действие оказывают вещества, которые прочно и необратимо связывают функциональные группы активного центра или препятствуют изменению валентности металла активного центра. К ним относятся:

1) ингибиторы металлосодержащих ферментов (HCN, RCN, HF, CO и др.). Эти соединения связываются с металлами с переменной валентностью (Cu или Fe), в результате чего нарушается процесс переноса электронов по дыхательной цепи ферментов. Поэтому эти ингибиторы называются дыхательными ядами.

2) ингибиторы ферментов, содержащих SH-группы (монойодацетат, дийодацетат, йодацетамид, соединения мышьяка и ртути).

3) ингибиторы ферментов, содержащих ОН-группу в активном центре (фосфороорганические соединения, инсектициды). Эти ингибиторы тормозят, прежде всего, активность холинэстеразы – фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Обратимое ингибирование поддается количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентные ингибиторы – это молекулы, настолько похожие на молекулы субстратов реакций, что ферменты «не могут их различить». В результате связывания конкурентного ингибитора с активным центром фермента уменьшается количество истинных фермент-субстратных комплексов и падает скорость катализируемой реакции. Классическим примером конкурентного ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Сукцинатдегидрогеназа катализирует окисление янтарной кислоты (сукцината) путем дегидрирования в фумаровую кислоту.

 

 

Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в результате структурного сходства с истинным субстратом - сукцинатом он будет реагировать с активным центром и образовывать фермент-ингибиторный комплекс, который не может подвергаться дальнейшим превращениям. Связывание конкурентного ингибитора не приводит к повреждению структуры активного центра фермента. Действие такого ингибитора устраняется путем увеличения концентрации субстрата. Таким образом, конкурентный ингибитор дает эффект «разбавления» субстрата. Поэтому при конкурентном ингибировании увеличивается значение Кm (концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной), но величина V_max остается постоянной (рис. 5).

 

Рис. 5. Влияние конкурентных ингибиторов на скорость ферментативной реакции

Метод конкурентного ингибирования нашел применение в медицинской практике, в виде использования антиметаболитов. Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и животных по конкурентному типу. Примером являются сульфаниламидные препараты, которые имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой (ПАБК).

Бактериальная клетка использует ПАБК для синтеза фолиевой кислоты, необходимой для образования нуклеиновых кислот. Благодаря структурному сходству сульфаниламид ингибирует ферменты метаболизма парааминобензойной кислоты, что приводит к снижению синтеза фолиевой кислоты, нуклеиновых кислот и гибели микроорганизма.

Неконкурентные ингибиторы – вещества, не имеющие структурного сходства с субстратами. Неконкурентные ингибиторы связываются не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента, в том числе и в области аллостерического центра. Обратимые неконкурентные ингибиторы понижают V_max за счет уменьшения количества действующих молекул фермента. Ингибиторы этого типа не мешают связыванию субстрата с активным центром сохранившихся молекул фермента, в результате величина K_m не меняется. Механизм ингибирования состоит в снижении скорости реакции за счет уменьшения количества нормальных фермент-субстратных комплексов. Таким образом, при неконкурентном ингибировании: V_max уменьшается, а K_m не изменяется (рис. 6).

Рис. 6. Влияние неконкурентных ингибиторов на скорость реакции.

Чаще встречается смешанный тип ингибирования, когда снижение V_max сочетается с одновременным увеличением K_m. Это означает: при соединении ингибитора с ферментом сохраняется возможность последующего присоединения субстрата с образованием тройного комплекса, что обеспечивает медленное превращению в продукт реакции.

В редких случаях возможно бесконкурентное ингибирование, обнаруживаемое при повышении концентрации субстрата. Один из возможных механизмов этого эффекта связан с соединением ингибитора с фермент-субстратным комплексом, что ведет к образованию неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса.

Специфическую группу ингибиторов ферментов составляют ингибиторы белковой природы. Они блокируют действие фермента за счет белок-белковых взаимодействий, в результате чего закрывается активный центр фермента. Особенно энергично белковые ингибиторы регулируют деятельность протеиназ клетки, поскольку в результате их действия тормозится переход проферментов в ферменты, отщепление сигнальных пептидов и других пептидных фрагментов при созревании белков, блокируются реакции протеолиза, ведущие к образованию биологически активных пептидов.

Регуляция ферментов через структуру белка

Активация проферментов. Происходит путем отщепления части полипептидной цепи от молекулы предшественника с образованием активного центра фермента. Этот путь характерен для агрессивных протеолитических ферментов, которые синтезируются в неактивной форме (проферменты) в желудке и поджелудочной железе и участвуют в переваривании белков. Синтез в виде проферментов исключает самопереваривание органов. Например, в поджелудочной железе вырабатывается химотрипсиноген. В кишечнике под действием трипсина происходит последовательно отщепление 2-х дипептидов и образуются три полипептидные цепи, соединенные дисульфидным мостиками. Это изменяет конформацию молекулы и формирует ее активный центр, в состав которого входит серин, гистидин и аспарагиновая кислота.

Специфический частичный протеолиз является распространенным способом активации ферментов и других белков в биологических системах. Рассмотрим некоторые примеры.

1. Свертывание крови является каскадом протеолитических реакций, обеспечивающим быстрый и усиленный ответ на повреждение тканей и кровеносных сосудов. При этом неактивные факторы свертывания последовательно превращаются в активные путем частичного протеолиза.

2. Многие гормоны пептидной природы синтезируются в виде предшественников (проинсулин, проопиомеланокортин), после частичного протеолиза которых образуются гормоны.

3. Нерастворимые в воде фибриллы коллагена возникают после частичного протеолиза водорастворимого проколлагена.

4. Запрограммированная гибель клеток – апоптоз опосредуется протеолитическими ферментами каспазами, которые синтезируются в виде прокаспаз.

Химическая (ковалентная) модификация. Заключается в присоединении к ферменту или отщеплении от него низкомолекулярной молекулы, при котором происходит активация или ингибирование фермента. Например, фермент, участвующий в синтезе гликогена – гликогенсинтаза – при присоединении фосфорной кислоты становится неактивным, а фермент распада гликогена – фосфорилаза – активным.

Фосфорилирование-дефосфорилирование является наиболее эффективным способом контроля активности белков по следующим причинам:

1. Фосфорильные группы приносят два отрицательных заряда в молекулу белка, что изменяет характер электростатических взаимодействий (например, изменяется связывание субстрата и каталитическая активность).

2. Фосфатная группа может участвовать в образовании трех или более водородных связей. Тетраэдрическая геометрия фосфорильной группы делает водородные связи строго направленными, что важно для межмолекулярных отношений.

3. Величина свободной энергии фосфорилирования белков достаточно высока: в макроэргической связи АТФ имеется -12 ккал/моль (-50 кДж/моль). Примерно половина тратится на фосфорилирование, а вторая половина депонируется в фосфорилированном белке. Такое Фосфорилирование может изменить конформационное равновесие между двумя состояниями белка в 10⁴ раз.

4. Фосфорилирование-дефосфорилирование занимает примерно секунду времени, что по скорости увязывается с физиологическими процессами.

5. Фосфорилирование носит, как правило, каскадный характер, с увеличением концентрации продукта на каждом этапе в 10 или более раз (амплификационный эффект фосфорилирования).

6. АТФ является энергетической валютой клетки. Фосфор освобождается в прямой реакции АТФ↔АДФ + Рн; фосфор потребляется в обратной реакции. Следовательно, процесс фосфорилирования-дефосфорилирования белков связан с концентрацией Рн и регуляцией метаболизма.

Аллостерическая регуляция. Происходит путем присоединения к аллостерическому центру фермента эффекторов – активаторов и ингибиторов. Если в роли активатора выступают молекулы субстрата – гомотропная активация, если какой-то другой метаболит – гетеротропная. Для аллостерических ферментов кривая насыщения субстратом представляет собой сигмоидную кривую, а не гиперболу как для нерегуляторных ферментов.

Для аллостерической регуляции характерны следующие признаки:

1. Аллостерические ферменты состоят из 2-х или более, часто симметричных, субъединиц, т.е. имеют четвертичную структуру.

2. Субъединицы фермента могут находиться в 2-х конформациях: R и Т. Конформация R (relax – расслабление) обладает высоким сродством к субстрату, конформация Т (tense – напряженная) – низким сродством. Формы R и Т могут переходить друг в друга.

3. Эффекторы связываются с T и R-конформациями фермента. Аллостерический ингибитор связывается преимущественно с Т-конформацией и ее стабилизирует. В присутствии ингибитора большая часть молекул находятся в T-конформации, что снижает сродство фермента к субстрату. Аллостерический активатор связывается преимущественно с R-формой.

4. Субъединицы аллостерических ферментов связаны между собой нековалентными связями. Изменение конформации одной субъединицы приводит к изменению конформации соседних субъединиц (кооперативный эффект).

Регуляция активности по принципу обратной связи (ретроингибирование). Во многих биосинтетических процессах основным типом регуляции скорости многоступенчатого процесса является ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт связывается с активным центром фермента и ингибирует его. Такие ферменты называются ключевыми, находятся на первых этапах метаболического пути и определяют скорость всего процесса.

Е1 Е2 Ех Еn А—® В ®... ® Y—® Z

 

 

Например, фермент аспартат-транскарбамоилаза осуществляет первый этап синтеза пиримидиновых нуклеотидов и ингибируется продуктом этого биосинтеза цитидинтрифосфатом (ЦТФ) по принципу обратной связи.

Активация предшественником (форактивация) – первый метаболит в многоступенчатом процессе активирует фермент, катализирующий первую или последнюю стадию.

 

Е1 Е2 Ех Еn А В... Y Z активация предшественником