Количественное определение белка

Различают две группы методов: 1) Определение количества белков в растворе на основе физико-химических свойств: биуретовый метод (основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди в щелочной среде); рефрактометрический и нефелометрический методы; поглощение ультрафиолетового излучения (при 280 нм поглощают УФО остатки ароматических аминокислот, при 180-210 нм - пептидная связь и ряд конформационных факторов). Используют закон Ламберта-Бэра А=εcl, где ε – коэффициент экстинкции (М^-1см^-1); с – концентрация вещества в растворе (М); l – длина пути светового луча в кювете (см). Для триптофана максимум абсорбции при 280 нм и коэффициент экстинкции равен

3400 М^-1см^-1, а для тирозина максимум абсорбции при 276 нм и коэффициент экстинкции составляет 1400 М^-1см^-1 (рисунок 4.1). Определение поглощения света длиной волны 280 нм используется для анализа концентрации белка в растворе (если известно количество остатков триптофана и тирозина в белковой молекуле).

2) Количественное определение индивидуальных белков на основе их биологических свойств (радиоиммунный, иммуноферментные методы).

Задача: в биологической жидкости имеется смесь белков (А+В+Х). Необходимо определить количество белка Х. Здесь общее определение количества белка не годится. Для количественного определения индивидуального белка Х в смеси белков предложен радиоиммунный метод. Рассмотрим его суть.

Первый этап: приготовление реагента для определения - чистым препаратом белка Х, полученным заблаговременно, иммунизируют животное. Против этого белка в организме животного образуются антитела. Их выделяют из крови и метят ¹²⁵I. Этот этап осуществляется на предприятиях, производящих наборы реагентов для радиоиммунного определения белка.

Второй этап: анализируют смесь белков, добавляя к ним меченое антитело в избытке. Меченное антитело связывает из-за специфического взаимодействия только белок Х. Этот комплекс выделяют, подсчитывают радиоактивность и определяют количество метки. По количеству метки определяют количество антитела Х, т.е. искомого белка. Метод весьма чувствителен, поскольку основан на специфичности белков, т.е. специфическом комплементарном взаимодействии индивидуальных белков.

В настоящее время нашел широкое распространение иммуноферментный анализ индивидуальных белков (ИФА), основанный на сродстве антитела к конкретному антигену (ELISA).

Напомним, что антитела продуцируют В-клети (В-лимфоциты). Каждая клетка системы иммунитета вырабатывает одно антитело, которое распознает отдельный участок (эпитоп, антигенную детерминанту) молекулы антигена. Поскольку в молекуле антигена присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками системы иммунитета. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называют поликлональными. Они вариабельны по количеству, в связи с чем не нашли применения в методе ELISA. Известно, что В-клетки не воспроизводятся в культуре. Но после слияния с миеломными клетками удалось получить гибридомы и выделить растущие и делящиеся в культуре клоны клеток, которые продуцируют высокоспецифичные моноклональные антитела. Их и используют в методе ELISA.

Моноклональные антитела широко применяются в настоящее время при определении полипептидных гормонов, маркеров опухолей, цитокинов, лекарственных препаратов, различных низкомолекулярных биорегуляторов, возбудителей инфекционных заболеваний.

ELISA включает следующие основные этапы:

1. Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, чаще используют пластиковые 96-луночные плашки.

2. К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить не связавшиеся молекулы первого антитела.

3. В лунку добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент, катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт (чаще, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза). Промывают лунку, чтобы удалить не связавшиеся молекулы конъюгата второе антитело-фермент.

4. Добавляют в лунку неокрашенный субстрат.

5. Проводят количественное (качественное) определение окрашенного продукта.

Основной принцип ELISA – специфическое связывание первого антитела с мишенью (белок, клетка). Применение моноклональных антител позволило существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом.

Если первое антитело не связывается с мишенью, то оно удаляется при первом промывании. Второму конъюгату антитело-фермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта.