Хроматография аминокислот на бумаге

М. Т. Генгин, А.Д. Кручинина

Лабораторный практикум по биохимии

Методическое пособие

для студентов

 

Пенза, 2010

Изучение курса биохимии невозможно представить без лабораторного практикума, который необходим для более углубленного понимания биохимических процессов. В каждой лабораторной работе практикума студенты выполняют экспериментальное исследование, результаты которого оформляются в виде отчёта. Лабораторный практикум способствует приобретению навыков работы в биохимической и химической лаборатории, формированию умения обрабатывать полученный экспериментальный материал и делать из него выводы. Лабораторный практикум содержит работы, способствующие усвоению некоторых современных методов биохимических исследований, некоторые из них легко могут быть воспроизведены на уроках химии и биологии в школе, что является особенно ценным для подготовки будущих учителей химии и биологии.

Методическое пособие «Лабораторный практикум по биохимии» содержит лабораторные работы по всему курсу биохимии, оформленные в виде рабочей тетради, а также вопросы и задания, способствующие более углубленному пониманию изучаемых процессов и явлений. Кроме того, каждая работа содержит теоретические сведения, расширяющие и дополняющие лекционный курс по биохимии.

 

Лабораторная работа № 1

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ. РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.

 

Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: 1) по пептидным связям, 2) по радикалам аминокислот. Примером реакции по пептидным связям может служить биуретовая реакция, все остальные качественные реакции на белки основаны на реакциях по радикалам аминокислот.

Биуретовая реакция основана на образовании комплексного соединения меди с енолизированными пептидными группами белков.

Нингидриновая реакция широко применяется для количественного определения аминокислот и пептидов в растворах и для проявления электрофореграмм и хроматограмм, полученных при разделении аминокислот и пептидов методами электрофореза на бумаге, тонкослойной хроматографии и хроматографии на бумаге.

Ксантопротеиновая реакция основана на нитровании радикалов ароматических аминокислот.

Реакция Адамкевича основана на взаимодействии формальдегида с триптофаном. Под действием концентрированной серной кислоты из глиоксиловой кислоты выделяется формальдегид, который конденсируется с триптофаном.

Реакция Паули основана на взаимодействии остатков тирозина и гистидина с диазобензосульфаниловой кислотой. При взаимодействии кислого раствора сульфаниловой кислоты с нитритом натрия осуществляется реакция диазотирования и образуется диазобензосульфоновая кислота, которая взаимодействует с гистидином с образованием соединения вишнево-красного цвета.

Реакция на «слабосвязанную серу» основана на отщеплении при щелочном гидролизе от остатков цистеина и цистина сульфид-аниона, образование которого обнаруживают при помощи ионов свинца Pb24, образующих с сульфид-анионами черный нерастворимый сульфид свинца. При щелочном гидролизе происходит также частичное дезаминирование аминокислот, сопровождающееся выделением аммиака.

Реакция Вуазене основана на взаимодействии формальдегида с триптофаном. Её механизм аналогичен механизму реакции Адамкевича.

Реакция Сакагучи основана на взаимодействии аргинина с α-нафтолом в присутствии окислителя.

Ход работы

Опыт 1.Биуретовая реакция

К 1-2 мл разбавленного белка прибавляют двойной объём 30% раствора гидроксида натрия, тщательно перемешивают и добавляют 2-3 капли 1% раствора сульфата меди. Снова перемешивают. Наблюдают развитие красно-фиолетовой окраски.

 

Опыт 2.Нингидриновая реакция

К 2-3 мл разбавленного раствора белка приливают 1 мл 1%-ного раствора нингидрина (ОСТОРОЖНО, ЯД!) в 95%-ном растворе ацетона. Раствор тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 10-15 минут. Наблюдается сине-фиолетовое окрашивание.

Опыт 3.Ксантопротеиновая реакция

К 1 мл раствора белка прибавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути денатурированного белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-жёлтый цвет. Смесь охлаждают и осторожно прибавляют по каплям, не взбалтывая, избыток концентрированного раствора щелочи. Жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Опыт 4. Реакция Паули.

К 0,5 мл 15-ного раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты приливают 1 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 1 мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 3 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. Наблюдается вишнёво-красное окрашивание.

Опыт 5. Реакция на «слабосвязанную серу».

К 0,5-1,0 мл неразбавленного белка добавляют двойной объём концентрированного раствора щелочи, кладут несколько «кипятильников», осторожно кипятят смесь (ВНИМАНИЕ! ЖИДКОСТЬ МОЖЕТ ВЫПЛЕСНУТЬ). При этом выделяется аммиак, который можно обнаружить по запаху и по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесённой к отверстию пробирки. К горячей жидкости приливают 1-2 мл раствора плюмбита натрия. Наблюдают коричнево-чёрное окрашивание.

Опыт 6. Реакция Вуазене.

К 2 мл разбавленного раствора белка прибавляют 1 каплю 2,5%-ного раствора формальдегида. После перемешивания прибавляют 6 мл концентрированной соляной кислоты и снова перемешивают. Через 10 минут прибавляют при перемешивании 10 капель 0,5%-ного раствора нитрита натрия. Наблюдают сине-фиолетовое окрашивание.

 

Содержание отчета

Полученные результаты заносят в таблицу.

 

Реакция	Окраска	Химические группы и связи, участвующие в реакции

 

Контрольные вопросы.

1. Напишите уравнения реакций всех выше проведенных опытов.
2. Чем обьясняется многообразие цветных реакций, которые дает белковая молекула?

3. Для количественного определения белков в биологических обьектах разработаны ряд широко используемых методов. Приведите два примера уравнений реакций, лежащих в основе этих методов.

 

Уравнения реакций и краткие ответы на вопросы.

РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

В состав белков входят различные химические группы, поэтому они вступают во взаимодействие со многими соединениями, а также конкурируют с ними за молекулы растворителя. Во многих случаях результатом указанных процессов является выпадение белка в осадок.

Высаливание неорганическими солями основано на агрегации белков своими гидрофобными участками. По мере сольватации ионов соли свободных молекул воды остаётся мало, возрастает тенденция к отрыву молекулы воды, входящих в состав упорядоченных оболочек молекул белка, с обнажением неполярных остатков, которые стремятся взаимодействовать друг с другом. Белки, содержащие на поверхности больше гидрофобных участков, агрегируют быстрее, меньше – медленнее. Осаждение белков солями является обратимым процессом, и при добавлении воды белки снова растворяются.

Осаждение органическими растворителями основано на снижении растворимости белков до уровня, при котором начинаются их агрегация и осаждение. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность молекул воды к сольватации заряженных гидрофильных участков молекул белков, что приводит к образованию агрегатов в силу электростатического притяжения. Проводится при низкой температуре (часто отрицательной) для предотвращения денатурации белков.

Осаждение органическими полимерами, которые можно рассматривать как полимерные органические растворители, основано на усилении электростатического притяжения. Этот метод ограничен высокой вязкостью растворов органических полимеров, практическое применение нашёл только полиэтиленгликоль.

Изоэлектрическое осаждение основано на агрегации многих белков в изоэлектрической точке вследствие снижения суммарного заряда молекулы и исчезновения сил электростатического отталкивания.

Осаждение избирательной денатурацией основано на преципитации денатурированных молекул белка вследствие того или иного воздействия. Метод ограничен и применяется для удаления примесных белков при очистке устойчивых к денатурации белков. Тепловая денатурация основана на денатурации сопутствующих белков под действием повышенной температуры. Денатурация путём изменения pH основана на денатурации примесных белков под действиес кислот или щелочей. Денатурация органическими растворителями основана на денатурации сопутствующих белков под действием органических растворителей при температуре порядка 20-30ºС.

 

Ход работы

Опыт 1. Высаливание белков сульфатом аммония.

В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония и слегка встряхивают смесь. Появляется муть от выпавшего осадка глобулинов. Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. Фильтрат делят на две части. Одну часть нагревают до кипения и наблюдают свёртывание альбуминов, находящихся в растворе. К другой части раствора добавляют избыток сухого сульфата аммония до прекращения его растворения. При этом появляются муть или хлопья выпадающих в осадок альбуминов.

 

Опыт 2. Осаждение белков спиртом.

В пробирку наливают 1 мл раствора белка и добавляют немного кристаллического хлорида натрия. Приливают постепенно 2-3 мл этилового спирта. При этом выпадает хлопьевидный осадок белка.

 

Опыт 3. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

В 3 сухие пробирки наливают по 1 мл концентрированных азотной, серной и соляной кислот. Затем, наклоняя каждую пробирку, приливают в неё из пипетки по 0,5 мл раствора белка так, чтобы он не смешивался с кислотой. В месте соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при добавлении азотной кислоты, увеличивается, а осадки, выпавшие при действии соляной и серной кислот, растворяются.

 

Опыт 4. Осаждение белков солями тяжёлых металлов.

В 2 пробирки наливают по 1 мл раствора белка и медленно, по каплям, при встряхивании припбавляют в первую пробирку раствор сульфата меди, а во вторую – раствор ацетата свинца. Выпадает хлопьевидный осадок голубого цвета в первой и белого цвета – во второй пробирке. При избытке реактива осадок снова растворяется.

 

Содержание отчёта.

Полученные результаты заносят в таблицу.

 

Реакция	Эффект	Химические группы и связи, участвующие в реакции

 

Контрольные вопросы.

1. Почему белки осаждаются концентрированными минеральными кислотами и в чем заключается причина исчезновения осадка в избытке соляной и серной кислот, в то время как в избытке азотной кислоты осадок, наоборот, увеличивается? Можно ли этот метод осаждения использовать при очистке белков?
2. Каков механизм лежит в основе осаждения белков солями тяжёлых металлов? Можно ли этот метод осаждения использовать при очистке белков?
3. Перечислите физико-химические свойства белков.

 

 

Лабораторная работа №2

ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ НА БУМАГЕ

Хроматография на бумаге – бумажная хроматография – один из видов распределительной хроматографии. Метод основан на различии коэффициентов распределения разделяемых веществ между двумя малосмешивающимися растворителями. В качестве носителя неподвижной фазы используют специальную хроматографическую бумагу. Она должна быть химически чистой, однородной по плотности и обеспечивать определённую скорость движения растворителя.

Исследуемое вещество, находящееся в растворе, наносят в виде капель на некотором расстоянии от края (линия старта) на лист хроматографической бумаги. Бумагу помещают в герметически закрытую камеру и погружают край листа, у которого был нанесён исследуемый раствор, в кювету, содержащую органический растворитель. Линия старта с нанесёнными на неё пробами недолжна погружаться р растворитель.

В силу капиллярности органический растволритель передвигается по листу бумаги. Нанесённое на бумагу вещество движется с током растворителя. Степень сорбции исследуемого вещества на гидратированных волокнах бумаги (воздушно-сухие листы бумаги в камере, насыщенной парами водонасыщенного органического растворителя, содержат до 20% воды) определяет скорость его передвижения. Вещества, хуже сорбирующиеся на гидратированных волокнах бумаги, передвигаются быстрее. После прохождения фронтом растворителя определённого расстояния бумагу высушивают и обрабатывают тем или иным проявителем. Параллельно с опытным раствором на тот же лист бумаги наносят стандартный раствор исследуемого вещества (свидетель), который указывает местоположение определяемого вещества. Для идентификации вещества также можно пользоваться величиной Rf, которая является отношением расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. Величина Rf зависит от растворителя и качества бумаги.

 

Реактивы и оборудование.

• Хроматографическая бумага: ватман 1-4, FN 2-5 или др.
• Элюирующий раствор (н-бутиловый спирт – уксусная кислота – вода (4:1:5); компоненты смеситщательно встряхивают 5-10 минут в делительной воронке и после расслаивания используют верхний слой.
• Растворы аминокислот-свидетелей (аланин, аргинин, фенилаланин, 10мг/мл).
• Исследуемая смесь.
• Раствор для окрашивания (0,2% раствор нингидрина на ацетоне).
• Сосуд для хроматографии, сушильный шкаф, вытяжной шкаф, пульверизатор, капилляры, карандаш, линейка.

 

Ход работы.

1. Подготовка бумаги

Вырезают полосу бумагидлиной 10 см и шириной 5 см. На расстоянии 1,5 см от конца полосы проводят остро отточенным простым карандашом стартовую линию и отмечают точки нанесения образцов на расстоянии 1 см от краёв и друг от друга. Точки можно подписать тем же карандашом.

ВНИМАНИЕ! Нужно избегать прикосновений пальцев к поверхности хроматографической бумаги, тапк как отпечатки пальцевмогут дать окрашивающиеся нингидрином пятна, которые затрудняют обработку результатов.

2. Нанесение образцов

Образцы наносят тонко оттянутым капилляром или наконечником от дозатора. Наносят по 2-3 мкл образцов, диаметр пятен при нанесении не должен превышать 2-3 мм.

 

 

3. Хроматографирование.

В сосуд для хроматографии наливают элюирующий раствор слоем в 2-3 мм, и вставляют лист бумаги с нанесёнными образцами. Закрывают сосуд притёртой крышкой и хроматографируют до тех пор, пока фронт растворителя не дойдёт до расстояния 1-1,5 см от верхнего края бумаги. После этого бумагу достают из камеры и высушивают в строго горизонтальном положении (можно в сушильном шкафу при температуре 60-70ºС).

4. Проявление хроматограммы нингидрином.

Раствор нингидрина наливают в пульверизатор и равномерно опрыскивают находящуюся в вертикальном положении хроматограмму. При этом категорически не допустимо образование подтёков. Хроматограмму высушивают под тягой и помещают в сушильный шкаф (температура – 60-70ºС) на 5-10 минут. Сопоставляя положение аминокислот исследуемого образца с положением аминокислот-свидетелей, определяют аминокислотный состав исследуемого образца. Кроме того, рассчитывают значение Rf для каждой аминокислоты.

 

Rf- выражается в цифрах от 0 до 1 и рассчитывается как отношение расстояния пройденного анализируемым соединением к расстоянию пройденному фронтом растворителя.

 

Содержание отчёта.

1. Хроматограмма.
2. Таблица.
3. Вывод о составе смеси.

 

Контрольные вопросы.

1. Охарактеризуйте принцип метода хроматографии. Какие носители используются при хроматогрфических методах разделения веществ?
2. На каком принципе основано разделение веществ при хроматографии на бумаге?
3. Зная принцип разделения веществ хроматографией на бумаге, предскажите распределение (последовательность расположения на хроматограмме) в использованной хроматографической системе следующих аминокислот: фенилаланина, тирозина, аланина, серина, глутамина, глутаминовой кислоты? Поясните ваши рассуждения.

 

 

Аминокислота	Расстояние вещества от старта, см	Расстояние растворителя от старта, см	Rf
аргинин аланин фенилаланин
смесь

 

 

Лабораторная работа № 3