ЦЕЛЬ: Изучить механизм образования и использования пирувата и ацетил‑КоА как общих метаболитов. Усвоить последовательность реакций цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) и его значение. Пользуясь схемой катаболизма основных пищевых веществ, уметь составить схемы: а) путей образования и окисления пирувата; б) путей образования и расходования ацетил-КоА.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ
1. Схема катаболизма основных пищевых веществ. Понятие об общих и специфических путях катаболизма.
2. Пируват как общий метаболит. Схема образования пировиноградной кислоты из белков, жиров и углеводов.
3. Окислительное декарбоксилирование пирувата. Схема и химизм реакций. Ферменты, коферменты, роль витаминов в их построении.
4. Энергетическое значение окислительного декарбоксилирования пирувата, связь с дыхательной цепью.
5. Ацетил-КоА как общий метаболит. Схема образования и пути использования.
6. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) – общий метаболический котёл организма. Последовательность реакций и характеристика ферментов.
7. Связь ЦТК с дыхательной цепью, сколько АТФ образуется за оборот?
8. Биологическая роль ЦТК, что понимают под амфиболичностью ЦТК?
9. Регуляция ЦТК. Какие ферменты являются регуляторными, какие метаболиты и как на них влияют?
10. Напишите структурные формулы субстратов окисления в цикле трикарбоновых кислот.
11. Напишите реакцию окисления в ЦТК, которая обеспечивает поступление электронов в укороченную дыхательную цепь.
12. Сколько молекул АТФ образуется в ЦТК путём субстратного фосфорилирования? Какой субстрат это обеспечивает?
13. Проследите за судьбой радиоактивной метки в одном обороте ЦТК, если к клеточному экстракту, содержавшему ферменты и кофакторы пируватдегидрогеназного комплекса в ЦТК, последовательно добавлять по одному из указанных ниже соединений (метка обозначена знаком– *).
H3C*–C–COOH, H3C–C–C*OOH, H3C–C*–COOH, H3C*–C– S-KoA
|| || || ||
O O O O
14. В ЦТК включается ацетил-КоА и оксалоацетат. Оксалоацетат регенерирует. На дыхательную цепь переносятся 8 водородов (протоны и электроны), тогда как в ацетил-КоА всего 3 водорода. Откуда поступают остальные 5?
15. В суспензию митохондрий добавили 0,6 ммоль/мл малата и 0,3 ммоль/мл АДФ. Поглощение кислорода, начавшееся сразу после добавления малата и АДФ, через некоторое время прекратилось. Почему? Затем к пробе добавили раствор фермента гексокиназы и раствор глюкозы. Поглощение кислорода вновь началось. Почему?
Таблица. РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФЕРМЕНТЫ ОБЩЕГО ПУТИ КАТАБОЛИЗМА
| Регуляторные ферменты | Ингибиторы | Активаторы |
| Пируватдегидрогеназный комплекс | АТФ, НАДН, ацетил-КоА | |
| Цитратсинтаза | АТФ, НАДН, сукцинил-КоА, ацил-КоА, цитрат | |
| Изоцитратдегидрогеназа | АТФ, НАДН | АДФ, АМФ |
| α-кетоглутарат-дегидрогеназный комплекс | НАДН, сукцинил-КоА |
Количественное определение пировиноградной кислоты в моче колориметрическим методом по Умбрайту.
Пировиноградная кислота является одним из промежуточных продуктов углеводного обмена. За сутки с мочой выделяется 113,7 – 283,9 мкмоль (10 – 25 мг) пировиноградной кислоты (ПВК). Содержание пирувата в крови здорового человека 0,4 – 1,2 мг в децилитре крови.
Принцип метода: ПВК, взаимодействуя с 2,4‑динитрофенилгидразином в щелочной среде, образует 2,4‑динитрофенилгидразон ПВК жёлто-оранжевого цвета, интенсивность окрашивания раствора пропорциональна концентрации пирувата.
СН3 NH–NH2 CH3
| | NO2 |
|
C=O C == N–NH
| | | + H2O
COOH HOOC NO2
|
NO2
|
2,4-динитрофенил- NO2
гидразин 2,4-динитрофенил-
гидразон ПВК
Порядок выполнения работы: Берут две пробирки, в опытную наливают 1 мл мочи, в контрольную – 1 мл дистиллированной воды. В обе пробирки приливают по 1 мл 2,5% спиртового раствора КОН. Перемешивают содержимое пробирок в течение 1 минуты. В каждую пробирку приливают по 0,5 мл 0,1% раствора 2,4-динтрофенилгидразина, перемешивают и оставляют на 15 минут при комнатной температуре для развития окраски. Пробу фотометрируют на ФЭКе против контроля с синим светофильтром. Расчёт проводят по калибровочному графику, найденную величину умножают на показатель суточного диуреза (мл).
Клинико-диагностическое значение. При авитаминозе и гиповитаминозе В1 в крови и других тканях, особенно мозге, накапливается большое количество ПВК и увеличивается её выведение с мочой. Содержание этой кислоты в крови и моче возрастает при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы.
 | |||||
 | |||||
 |
ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:
1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 343-353.
2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 281-294.
3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 212-221.
4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия: Учебник. –М.: Медицина, 2000, с. 80-86.
5. Лекционный материал.
Дополнительная литература:
1. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /Под ред. Члена-корренспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).
2. Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.
3. Скулачёв Б.П. ‘‘Биоэнергетика. Мембранное преобразование энергии’’, М.: Высшая школа, 1989.
