Возможные источники ошибок при подсчете эритроцитов

Определение количества эритроцитов в крови (в счетнойкамере)

Цель работы: знакомство с классическим методом подсчета эритроцитов в периферической крови.

Для работы необходимы: исследуемая кровь, смеситель (меланжер) для эритроцитов, камера с сеткой Горяева, 3%-ный раствор хлористого натрия, микроскоп, спирт, вата, груша.

Ход работы

Разведение крови

Перед началом работы необходимо ознакомиться с устройством меланжера и с сеткой счетной камеры. Меланжер для подсчета эритроцитов представляет собой капилляр с ампулообразным расширением и с бусинкой красного цвета (Рис 1). На меланжер нанесены три метки: 0,5; 1,0; 101; кровь обычно набирают до метки 0,5, а затем добавляют физиологический раствор до метки 101, чем достигают разведения в 200 раз. При заборе крови и ее разведении, во избежание нарушения точности анализа нельзя допускать попадания пузырьков воздуха. Покачиванием смесителя, отверстия которого зажимают между пальцами, кровь тщательно перемешивают для равномерного распределения эритроцитов.

Заполнение счетной камеры

Счетная камера (Рис. 2) состоит из толстого прямоугольной формы стекла с двумя сетками Горяева, нанесенными на середине площади камеры. Кнаружи от желобов, образующих букву «Н», находятся две прямоугольные пластинки, к которым притирается шлифованное покровное стекло. Сетка Горяева (Рис. 3) состоит из 225 больших квадратов, 25 из которых разделены поперечными и продольными полосами на 16 малых. Сторона малого квадрата составляет 1/20 мм, площадь – 1/400 мм2, глубина камеры – 1/10 мм, следовательно, объем камеры над малым квадратом равен 1/4000 мм3. Перед заполнением камеры ее и покровное стекло промывают водой, протирают ватным тампоном, смоченным эфиром или спиртом, а затем сухой полотняной салфеткой. Затем притирают покровное стекло к боковым поверхностям камеры скользящими и давящими движениями больших пальцев обеих рук до появления радужных (ньютоновых) колец.

Перед заполнением камеры выпускают на ватный тампон две-три капли содержимого из капилляра, затем заполняют камеру, нанося каплю разведенной крови на среднюю пластину у края покровного стекла. В силу капиллярности жидкость равномерно распределится над сеткой. После __ｴCX_Tзаполнения камеру оставляют на одну минуту для равномерного распределения и оседания эритроцитов.

 

 

 

 

Рис.1. Смесители для подсчёта эритроцитов и лейкоцитов.

Подсчет эритроцитов

Камеру кладут на предметный столик микроскопа, установленный горизонтально, и приступают к подсчету эритроцитов при малом увеличении микроскопа (объектив 8х, окуляр 10х или 15х). Поле зрения должно быть затемнено диафрагмой и несколько опущенным конденсором. Подсчитывают эритроциты в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых (всего в 5×16 = 80 малых квадратах), расположенных по диагонали. Во избежание двукратного подсчета клеток, лежащих на границе квадратов, руководствуются правилом Егорова: считают эритроциты, находящиеся внутри квадрата и на его верхней и левой границах.

 

Рис.2. Общий вид счетной камеры.

Результаты подсчета фиксируют, определяют суммарное количество эритроцитов, найденных в 80 малых квадратах, и рассчитывают количество клеток в 1 мкл крови по формуле: Х = А•4000•200/80, где

Х – искомое число эритроцитов в 1 мкл;

А – число эритроцитов в 80 малых квадратах;

1/4000мм3 – объем разведенной крови над одним малым квадратом;

80 – число малых квадратов;

200 – степень разведения.

Полученное число умножают на 106 и получают содержание клеток в 1 л крови.

Ошибка метода составляет ±2-3%.

Возможные источники ошибок при подсчете эритроцитов

1.Образование сгустка во время взятия и разведения крови.

2.Несоблюдение условий, обеспечивающих должную высоту камеры (неправильный выбор покровного стекла и плохое его притирание к камере).

3.Проведение подсчета сразу после заполнения камеры, когда клетки еще не распределились равномерно и не осели.

4.Попадание воздуха в капилляр с кровью.

большой квадрат

малый квадрат

 

Рис. 3. Фрагмент сетки Горяева.

В протокол вносится изображение сетки Горяева с обозначением большого и малого квадратов, указывается количество эритроцитов в больших квадратах, а также приводятся формула расчета и полученный результат. В заключении сравнивают результаты подсчета с физиологической нормой. При значительном отклонении полученного результата от физиологической нормы следует исключить ошибки проведения работы.