Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче

 

А. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц

 

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ: 1.3.99.1) – единственный фермент цикла трикарбоновых кислот Кребса, прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий (комплекс II). Коферментом СДГ служит ФАД, акцептирующий два атома водорода от молекулы сукцината и переносящий их непосредственно на коэнзим Q (убихинон) в дыхательной цепи митохондрий. ФАД прочно связан с молекулой СДГ.

Цель работы

Убедиться в способности сукцинатдегидрогеназы мышечной ткани проявлять активность в анаэробных условиях.

Принцип метода

Доказательством проявления активности СДГ может служить изменение окраски искусственного акцептора водорода метиленового синего:

Выполнение работы

 

Так как восстановленная форма метиленового синего вновь окисляется на воздухе, опыт проводят в анаэробных условиях, предотвращая доступ кислорода наслаиванием на поверхность пробы вазелинового масла. Контролем служит гомогенат мышц, в котором СДГ инактивирована кипячением. Критерием активности СДГ служит время обесцвечивания опытной пробы в присутствии сукцината в анаэробных условиях.

 

 

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Гомогенат мышц (мясной фарш), мл
Нагревают при 100°С в течение 5 минут на водяной бане, а затем охлаждают до комнатной температуры	—	+
0,05 М Фосфатный буфер, рН 6,8, мл
5 мМ Сукцинат, мл
Метиленовый синий, 0,05% раствор, капли
Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой, заливают вазелиновым маслом и инкубируют при комнатной температуре
Окраска
Время обесцвечивания

 

Выводы

 

Б. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче

ПВК является промежуточным продуктом распада углеводов в организме. Она содержится во всех органах и тканях.

Клинико-диагностическое значение

Содержание ПВК в крови и моче возрастает при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы, токсикозах, при введении некоторых лекарственных средств, а также при недостаточности тиамина.

Цель работы

Определить количество пировиноградной кислоты и сравнить полученные результаты с нормой.

Принцип метода

Пировиноградная кислота, взаимодействуя с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФ-гидразин), в щелочной среде образует 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты жёлто-оранжевого цвета, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.

Реакция протекает по уравнению:

ПВК

2,4-ДНФ-гидразин

2,4-ДНФ-гидразон пировиноградной кислоты

Выполнение работы

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Моча, мл		—
H2O, мл	—
Спиртовой раствор КОН (2,5%), мл
Перемешивают в течение 1 минуты
2,4-ДНФГ (0,1% раствор в 2 М НС1, мл	0,5	0,5
Инкубируют 15 мин при комнатной температуре
Фотометрируют против Н2О (l = 490 нм, толщина кюветы 0,5 см). D490
Dоп - Dк

Строят калибровочный график зависимости D₄₉₀ от содержания ПВК.