Объединение фрагментов ДНК

При объединении фрагментов ДНК возникают две пробле­мы — структурная (проблема совместимости концов объединяе­мых фрагментов) и концентрационная (проблема соотношения кон­центраций объединяемых фрагментов).

Непосредственное объединение. Без предварительной подго­товки лигируют рестрикты, имеющие совместимые концы — лип­кие или ровные. Липкие концы объединяются в результате комп­лементарных взаимодействий с последующим действием ДНК-лигазы. Фрагменты ДНК с ровными концами объединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Ввиду низкой эф­фективности этой реакции концентрации ДНК и фермента при этом должны быть на порядок выше, чем при объединении липких концов. Если векторные молекулы и чужДНК обработаны одной рестриктазой или их изошизомерами, то клонируемый фрагмент можно "вырезать" из рекДНК с помощью тех же рестриктаз. Ход операций по лигированию контролируют электрофорезом в геле.

Лигирование молекул ДНК, обладающих совместимыми кон­цами, неизбежно сопровождается их циркуляризацией вследствие объединения собственных концов, что снижает выход рекДНК. Удач­ный выбор концентраций ДНК уменьшает влияние этого фактора.

Ферментативная модификация концов. Модификацию кон­цов лигируемых молекул ДНК проводят для разных целей. В част­ности, основное средство предотвращения циркуляризации моле­кул — предварительная обработка щелочной фосфатазой E.coli меньшего по размеру компонента (обычно это линеаризованный вектор), после чего концы таких молекул не замыкаются друг с другом лигазой из-за отсутствия у них фосфатных групп. В то же время клонируемый фрагмент встраивается в векторную молекулу благодаря наличию у него этих групп. Оставшиеся де­фекты в рекДНК устраняются in vivo после трансформации клеток.

Рис. Способ предотвращения рециркуляризации вектор­ной ДНК с помощью фосфатазы

Частая процедура в молекулярном клонировании — перекло­нирование фрагмента ДНК, т. е. его перенос из одного вектора в другой. При этом обычно возникает проблема несовместимости концов фрагмента и нового вектора, которая решается нескольки­ми способами.

В случае необхо­димости переклонирования используют векторы, имеющие в себе полилинкеры, или применяют линкеры и адаптеры.

Использование линкеров. Синтетические олигонуклеотиды — линкеры и адаптеры применяют для объединения фрагментов ДНК, имеющих концы различного строения, и для введения специаль­ных последовательностей в места соединения.

Линкерами называют однонитевые самокомплементарные оли­гонуклеотиды, которые образуют дуплексы, имеющие ровные кон­цы и содержащие сайты рестрикции (выделены шрифтом):

Линкеры используют также для объединения молекул ДНК, обладающих ровными концами неопределенного строения, с це­лью образования сайта рестрикции на стыке молекул. Для клони­рования больших фрагментов ДНК удобны линкеры, содержащие сайты узнавания для редкощепящих рестриктаз.

Использование адаптеров. Адаптерами называют одно- или двунитевые олигонуклеотиды, предназначенные для объединения молекул с несовместимыми концами. У дуплексов концы раз­ные: один конец ровный, а другой ступенчатый, либо оба конца ступенчатые. Адаптеры применяют, когда концы векторных и клонируемых молекул образованы различными рестриктазами, а также когда в клонируемых фрагментах ДНК есть сайты исполь­зуемых рестриктаз.

Однонитевые адаптеры применяют для объединения молекул ДНК с 5'- и З'-выступающими концами.

Двунитевые адаптеры с различными выступающими концами способны изменять выступающие концы ДНК. Такие адаптеры называют конверсионными. Примером их может служить адаптер EcoRI-BamHI, с помощью которого Bam-НI-концы можно заменить ЕсоRI-концами и интегрировать модифицированные таким образом фрагменты ДНК в EcoRI-сайты векторов.