Биотехнология в производстве витаминов

Получение лекарственных веществ на основе применения биологического синтеза

Одним из перспективных путей получения ЛВ является биотехнология с использованием методов генной инженерии. Ее основу составляют генетические ресурсы, заложенные в клетках растений, животных и микроорганизмов. Современный уровень развития химии, биологии и других наук позволяет изменять молекулы, входящие в состав биологических систем, и создавать их варианты, которые не могли появиться в процессе естественной эволюции.

Биотехнология обеспечивает самые прогрессивные методы получения новых ЛВ. Начиная со второй половины 70-х гг. создана отрасль биотехнологии, обеспечивающая получение ЛВ на основе использования генной инженерии. С помощью генной инженерии были разработаны новые штаммы микроорганизмов, позволившие получить гормональные вещества, осуществить микробиологический синтез инсулина, интерферона и других ценных веществ, синтезируемых только организмом человека.

Чрезвычайно важно, что в качестве источников сырья для биотехнологии все шире используются непищевые растительные ресурсы и отходы сельского хозяйства, пищевой промышленности. Это позволяет превратить биотехнологию в безотходное производство. Сравнительная оценка продолжительности традиционных и биотехнологических методик убедительно подтверждает преимущества последних.

 

Традиционная методика получения ЛВ путем выращивания растений на опытном поле требует длительного времени (1-6 мес.). Более экономично использование биотехнологической методики, основанной на выращивании каллусных и меристемных клеточных культур (7-14 дней). При получении биологически активных веществ из животных тканей традиционный способ разведения животных требует 1-9 мес., выращивание культуры клеток ткани на твердой фазе — 7-10 дней. Меньше всего времени, всего 1-3 дня, требуется для получения БАВ путем культивирования микроорганизмов, так как они растут быстрее клеток растений и животных и требуют простых питательных сред.

 

Микробиологический синтез

Микробиологический синтез витаминов и коферментов все шире включается в новые технологические схемы. Использование достижений в области физиологии микроорганизмов — продуцентов БАВ — позволяет оптимизировать биосинтез и увеличивать их выход. Использование в промышленности указанных методов дает возможность применять более дешевые источники сырья, увеличивать выход продукции, заменять дорогостоящие и трудоемкие стадии химического синтеза.

Большинство органических кислот получают химическими методами из продуктов переработки нефти и сухой перегонки древесины. Однако, когда кислота используется для пищевых или медицинских целей или синтез ее является сложным, целесообразно использовать микробиологические методы. Сейчас лимонную, глюконовую, кетогулоновую и итаконовую кислоты получают только микробиологическим путем, а молочную и уксусную — как химическим, так и микробиологическим методами. Многие из этих кислот либо сами являются ЛВ, либо используются в качестве исходных продуктов их синтеза или получения солей. Основным сырьем для производства органических кислот ранее служили углеводы (глюкоза, сахароза, крахмал). Начиная с 60-х гг. XX в. для этой цели все шире используется непищевое сырье — нормальные парафины нефти в сочетании со специально селекционированными штаммами дрожжей.

Биотехнология аминокислот

Аминокислоты являются составными элементами белков. Все 20 аминокислотявляются мономерами для построения природных полипептидов и хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны). Известно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров (вспомните теорию строения органических соединений Бутлерова А.М., открывшего ассиметрию атома углерода с четырьмя заместителями, определяющими направление и степень вращения плоскости поляризованного света).

Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать L- и D-формы аминокислот, но только как рацематы, дальнейшее разделение которыхпредставляет трудную задачу и экономически не эффективно.

Другой способ получения аминокислот – это микробиологический синтез, когда используют штаммы-продуценты, осуществляющие сверхсинтез аминокислот. Избыточные количества аминокислот, например, L -лизина, L –глутаминовой кислоты, L -треонина, L –трептофана экскретируются (выходят) в культуральную (внешнюю) среду. Культуральная среда в этом случае можетсодержать от четырех, пяти и до ста граммов целевой аминокислоты на одинлитр жидкой фазы. В отличие от химического синтеза, в этом случае, то есть прибиосинтезе аминокислот с помощью ферментных систем микроорганизмов,получаются исключительно L-формы аминокислот, обуславливающих терапевтический эффект, а не рацематы. Это обстоятельство решает проблему выбора получения аминокислот в промышленном масштабе в пользу биотехнологических методов.

Аналогичная ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Химический синтез, как правило, не эффективен. Именно поэтому в фармацевтической промышленности антибиотики получают с помощью штаммов-продуцентов, которые генерируют нужный антибиотик в определенной фазе роста в заданном режиме культивирования. Однако, использование вдальнейшем химической трансформации природных антибиотиков рождаетновые лекарственные средства и помогает преодолевать резистентностьмикроорганизмов к лекарственным препаратам, повышая эффективностьлечения.

 

Сегодня известны 4 метода получения аминокислот:

1. химический метод (тонкий органический синтез)

2. химико-энзиматический метод (энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием биологически активных L-изомеров). Метод достаточно дорогой.

3. биологический метод (применение гидролиза белоксодержащих субстратов)

4. прямой микробиологический метод (получение L-аминокислот). Методболее дешевый, экономически выгодный.

 

Наиболее распространенными методами получения аминокислот являются химико-энзиматический и микробиологический.

 

В качестве примеров использования химико-энзиматического метода можно привести:

• синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой (используются клетки

Escherichiacoli)

• синтез L-фенилаланина из коричной кислоты (используются клетки

дрожжей).

Имея задачу получения аминокислот, используя природные микроорганизмы,надо помнить о механизмах регуляции биосинтеза по принципу обратной связи (ретроингибирование). Эта регуляция осуществляется либо за счетингибирования активности одного из начальных ферментов собственногосинтеза избыточным продуктом, то есть самой аминокислотой, либорепрессируется весь комплекс ферментов всей биохимической цепочкиметаболизма клетки, что является естественной реакцией живогомикроорганизма-продуцента для сохранения собственного равновесия наклеточном уровне. Таким образом перед биотехнологом стоит задача в нарушении этих механизмов, чтобы иметь возможность получить целевойпродукт в необходимых количествах.

Как это делается, можно рассмотреть на примере продуцентов лизина (Corynebacteriumglutaminicum) итреонина (Escherichiacoli).

У Corynebacteriumglutaminicum есть принцип согласованного ингибированияферментативной активности, что является особенностью биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клеткевозможно только при повышенной концентрации обеих конечных продуктов –лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента –аспартакиназы. Они ингибируют этот синтезтолько вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника – гомосерина.

Действительно, большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам.

Таким образом большинство продуцентов лизина нуждается в присутствии гомосерина или треонина, иначе они работать не будут. Зная это, биотехнолог, выращивая такие продуценты, должен обязательно вносить в питательнуюсреду от половины грамма и до полутора граммов на один литр гомосерина или треонина. В этом случае происходит активный рост биомассы продуцента безсинтеза лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассыпрекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данныйпроцесс имеет две стадии развития:

1. рост биомассы

2. синтез лизина

Продолжительность синтеза составляет 2-3 суток. Уровень накопления продукта составляет 50-100 граммов на литр. Это особенности биосинтезализина.

Второй пример. Минтезтреонина. Особенности регуляции биосинтеза треонина в клетках Escherichiacoli (кишечной палочки). В этом случаеситуация другая. У кишечной палочки нет механизма согласованногоингибирования ферментативной активности, то есть, если лизин ингибируетактивность своих ферментов по принципу обратной связи, то треонин – своихферментов. Кроме того, имеет место «репрессия» всего комплекса треониновых ферментов при избытке треонина или изолейцина и это похоже на«согласованную репрессию» Самостоятельно (по отдельности) ни треонин, ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов.

Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее:

1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый ферменттреонина

2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин

3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина не смотря на избыток треонина

4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента)

 

В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизинатем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий.

Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату:

1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислотклетками продуцента

2. достигается максимальная длительность работы продуцента

3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот.

 

Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы ипомогают в этом случае наличие в питательной среде:

· источников углерода,

· аммонийного азота,

· минеральных солей,

· ростовых факторов;

· оптимизация рН (кислотность среды)

· температуры;

· дробная подача субстратов.

Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН-статирвоание аммиачной водой и источниками углерода.

В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по меренеобходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры.Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации иперемешивания.

Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательнуюсреду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты).

Внимание! Синтез нужной аминокислоты может прекращаться, если на еепродуцент действуют его токсические метаболиты, которые синтезируютсясамим продуцентом. Например, в процессе биосинтеза фенилаланина, продуцентом которого является Bacillussubtilis, этот продуцент синтезирует примеси ацетоина и бутандиола, в результате этого клетки продуцента лизируются, образуют споры и прекращают вырабатывать фенилаланин. Чтобыизбежать это явление, необходимо ферментацию вести в условиях лимита(ограничения) по источнику углерода. В этом случае весь сахар расходуется только на синтез фенилаланина, увеличивая как количество (в два раза), так ичистоту получаемого продукта.

 

Как итог можно сказать, что:

- эффективность использования субстрата при биосинтезе аминокислот зависит от продуктивности биомассы,

- если синтез аминокислот разобщен с ростом биомассы (лизин), то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше будетработать культура после остановки роста,

- если же синтез аминокислоты идет параллельно росту биомассы (треонин), то эффективность биомассы можно увеличить добавляяопределенное количество предшественников.

 

Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии – введение в клетку продуцента многокопийных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезубиомассы и других клеточных компонентов.

 

С помощью гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот мы получаем:

1. рост продуктивности биомассы.

2. исчезновение примесей (более чистый продукт).

3. возрастает коэффициент использования субстрата (его минимум даетмаксимум продукта).

 

Биотехнология в производстве витаминов

Витамины представляют группу незаменимых органических соединенийразличной химической природы. Они необходимы любому организму внебольших концентрациях с целью выполнения в нем каталитических ирегуляторных функций. Они не являются материалом для биосинтетическихпроцессов, они не являются источниками энергии.

Что касается источника витаминов – это в первую очередь растения. Витамины поступают в организм человека с пищевыми продуктами. Недостаток витаминов может привести к различным заболеваниям (это цинга,различные анемии и так далее).

 

Использование витаминов:

1. это лечебные препараты

2. это компоненты сбалансированного питания

3. это компоненты парфюмерной продукции

4. это биологически активные добавки

5. это компоненты для интенсификации биотехнологических процессовпроизводства.

 

Известно, что высокой биологической активностью обладают, как правило,не сами витамины, а их производные – коферменты. Открыты также коферменты, для которых не обнаружено витаминных аналогов. Коферментные формы на основе различных витаминов обладают широким спектром действия и эффективно используются в медицинской практике.

Большинство витаминов либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Однако, с помощью биотехнологии сегодня производят особо сложные по строению витамины В2, В12, β-каротин (провитамин А), РР и предшественники витамина Д (эргостерина).

Кроме того, в синтезе витамина С (аскорбиновой кислоты) используют микроорганизмы как селективные окислители d-сорбита в L-сорбозу.

 

Получение витамина В2 (рибофлавин). Вначале этот витамин выделяли из природного сырья (в максимальных концентрациях он присутствует в моркови и в печени). Затем был разработан как химический, так имикробиологический способы промышленного синтеза. Для рибофлавина характерно функционирование в коэнзимных формах:

-флавиномононуклеотид (ФМН)

-флавинадениндинуклеотид (ФАД).

 

К источникам рибофлавина относятся:

-высшие растения.

-дрожжи.

-мицелиальные грибы.

 

Активным продуцентом рибофлавина являются культура дрожжеподобного гриба Eremotheciumashbyii и Ashbyagossipii.

Сверхсинтез рибофлавина можно получить, если действовать на дикиештаммы мутагенами, нарушающими механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды.

 

В состав среды для роста продуцентов рибофлавина входят:

-соевая мука

-кукурузный экстракт

-сахароза

-карбонат кальция

-хлорид натрия

-витамины

-технический жир.

 

Перед подачей в ферментер среду стерилизуют с помощью антибиотиков иантисептиков во избежание ее инфицирования. По завершении процесса ферментации культуральную жидкость концентрируют, высушивают исмешивают с наполнителями. В 1983 году в институте генетики был сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillussubtilis, способный синтезировать в три раза больше по сравнению с Eremotheciumashbyii и этот продуцент более устойчив к экзогенной кантаминации.

 

Получение витамина В12.

Этот витамин был открыт одновременно в США и в Англии. В 1972 г. В Гарвадском университете был осуществлен химический синтез витамина В12, включающий 37 стадий его получения, что лишало возможности организовать промышленное производство этого витамина. С другой стороны это производство было необходимо, так как витамин В12 очень важен в коррекции определенных нарушений в организме человека и животных. Он регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование гемоглобина, применяется для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени и в другихслучаях.

Сначала витамин В12 получали исключительно из природного сырья (1 тонна печени – 15 миллиграмм витамина).

Единственный способ его получения в настоящее время – этомикробиологический синтез в промышленном масштабе. Интересно, что обнаружение витамин В12 как побочного продукта при производстве антибиотиков стимулировало поиск продуцентов этого витамина.

Продуцентом витамина В12 являются пропионовокислые бактерии из рода Propionibacterium. Применение мутантов и добавление в средупредшественника витамина В12 - 5,6 диметилбензимидазола (5,6 ДМБ) резко повышает продуктивность продуцента. Этому способствует также добавлениев питательные среды кукурузного и мясного экстракта, соевой муки, рыбной муки. Выращивание пропионовых бактерий производится периодическим методом в анаэробных условиях на среде с кукурузным экстрактом, глюкозой,солями кобальта и сульфатом аммония. Образующиеся кислотынейтрализуются щелочью. Через 72 часа после начала ферментации вносят предшественники - 5,6 ДМБ. Длительность ферментации – трое суток.

Полученную массу сепарируют, стабилизируют нитритом натрия, охлаждают, нейтрализуют, коагулируют белки и фильтруют. Очищают на ионообменной смоле, кристаллизуют и проводят химическую очистку продукта. Далее следует получение различных лекарственных форм поливитаминных препаратов. Для увеличения производства витамина В12 перспективным является применение генной инженерии при получении гибридных штаммови использовании методов иммобилизации на полимерах.

 

Витамин В3 (пантотеновая кислота). Способ получения – тонкий органический синтез и микробиологический синтез с использованием иммобилизованных клеток бактерий, актиномицетов (основной метод).

Витамин РР. Используется биотехнологический метод, метод экстракции из микроорганизмов, обычно из пекарских дрожжей с добавлением предшественников. Используется штамм – Brevibacterium ammoniagenes.

 

Аскорбиновая кислота. Здесь применяется в основном химический синтезилишь одна стадия осуществляется биотехнологическим способом с применением уксусно-кислых бактерий, проводящих реакциютрансформации d -сорбита в L-сорбозу. Для получения сорбозы культуру продуцента Gluconobacteroxydans выращивают в ферментерах периодического действия с мешалкой, барботером, усиленной аэрацией в течение 20-40 часов. Выход сорбозы достигает 98% от начального сорбита. Питательная среда: кукурузный дрожжевой экстракт до 20%. Сорбозу выделяют из культуральной жидкости. Развитие микробиологического метода получило развитие в производстве 2-кето L -гулоновой кислоты – это промежуточный продукт синтеза витамина С.

Продуценты: Acetobacter, Erwinia,Gluconobacter. Перспективно создание генноинженерных штаммов продуцентов.

 

Эргостерин (витамин Д2)

Эргостерин – это основной компонент стеринов дрожжеподобных грибов рода Candida, использующих углеводы. Есть несколько вариантов выращивания дрожжей – продуцентов эргостерина.

Продуценты – это дрожжи, плесени, особенно Saccharomycescerevisiae.

Питательная среда должна содержать источники углерода, азота, фосфора.

Ферментация идет в аэробных условиях около 12-20 часов. Для получения кристаллического витамина Д2, биомассу гидролизуют, охлаждают, фильтруют, делают спиртовые экстракты, которые омыляют (обрабатывают щелочью), кристаллизуют, очищают, растворяя в эфире, удаляют эфир, а затем эргостерин облучают ультрафиолетовыми лучами (УФ-облучение), так как витамин Д 2 из эргостерина образуется только после ультрафиолетового облучения (УФ-облучения).

Источником получения эргостерина может служить и мицелий грибов, который остается как отход (побочный продукт) антибиотической промышленности. Микроорганизмы Cryptoccocuscurvatus на средах с отходами молочной промышленности и при переработке хлопка синтезируют значительные количества эргостерина. Это все относится к вопросу рентабельности и экологичности биотехнологического производства.

β-каротин. Каротиноиды (политерпены) – это природный пигмент. Общий путь биосинтеза из изопреновых единиц. Источник – это высшие растения, водоросли, микроорганизмы. Получение - это тонкий органический синтез (химический способ) и биотехнология (использование мицелиальных грибов).

Питательная среда – кукурузно-соевая среда. Процесс получениямногостадийный. β-каротин экстрагируется подсолнечным маслом ииспользуется в виде масляных Если используют химический синтез, то болеерентабельно после экстракции егокристаллизовать.

 

Витамин РР – в его производстве используется биотехнологический метод, применяя способ экстракции из микроорганизмов, обычно это пекарские дрожжи. В качестве штамма используется Brevibacterium ammoniagenes.

Убихиноны (коферменты Q).

Эти соединения синтезируются в организме животных и человека. Участие убихинона в метаболических процессах проявляет регуляторныйэффект, он же принимает участие в тканевом дыхании, окислительном фосфолирировании, в переносе электронов.

Получение убихинонов – это биотехнология на основе каллусных культур риса или опухолевой ткани. Продуценты – бактерии, дрожжи идрожжеподобные микроорганизмы. Сухая масса грибов рода Candida содержит смесь убихинонов. Это один из примеров, когда биотехнологиясовмещает в едином процессе получение убихинонов и эргостерина из микробных липидов. Применение убихинонов – при ишемической болезнисердца и при повышенных нагрузках.

Уксуснокислые бактерии, используемые при окислении сорбита в сорбозу (при получении витамина С) содержат убихинон-10)с десятью изопреновыми единицами в боковой цепи, который является коферментом организмачеловека.

 

Заключение.

1. Применение генной инженерии при синтезе витамина В2 и витамина С– открыло новые возможности селекции высокоактивных продуцентов.

2. Внедрение непрерывного способа ферментации в производстве сорбозы увеличило скорости образования этого сахара почти в два раза.

3. Дробная подача компонентов в питательные среды обеспечило высокийуровень ферментации в производстве витамина В12 и сорбозы.

4. Применение иммобилизованных клеток при получении витаминов В12и В3 привело к разработке новых конструкций биореакторов.

5. Утилизация различных промышленных отходов существенно снижаетсебестоимость получаемой продукции – витаминов В2, В12 и β-каротина, улучшает экологию производства.

 

Таким образом, получение этих важных биологически активных веществ(БАВ) свидетельствует о существенном вкладе биотехнологии и в этомсекторе фармацевтической промышленности.