Принципи генно інженерного конструювання у бактерій

Дослідження генома мікроорганізмів, принципів його організації та функціо­нування мас важливе значення для направленої селекції високопродуктивних штамів, які використовуються у промисловості.

У виробництві різних мікробних препаратів застосовують природні штами, штами, змінені у результаті мутації або одержані методами генної та клітинної інженерії. У виробництвах, де цільо­вим продуктом с не біомаса, а речовини, що виділяються клітинами у середовище, використовують генетично змінені штами.

Теоретично мутації, які сприяють надсинтезові продукту, можуть зачіпаги велику кількість структурних генів, кодуючих ферменти всіх етапів синтезу, транспортування і катаболізму цього продукту, а також регуляторні гени. Результати мутацій можуть проявлятися в різних змінах метаболізму клітини:

І) підвищення рівня синтезу ферментів або їхньої активності (наприклад, мутанти з порушеною структурою білка-репресора чи алостеричною нечутливістю);

2) блокування подальшого внугрішньоклітинного перетворення метаболіту;

3) блокування деградації продукту;

4) забезпечення ефективної екскреції продукту з клітини;

5) посилення позитивного регулювання синтезу продукту тощо.
Методом індукованого мутагенезу одержано більшість продуцентів антибіо-
тиків, ферментів, органічних кислот, вітамінів, амінокислот тощо.

Важливе значення для створення штамів із заданими ознаками мають методи передачі (трансформація, трансдукція, кон'югація) генетичної інформації в клітину-реципіснт. Однак обмін ділянками ДНК у цих випадках найчастіше обмежений штамами одного виду і мас однонаправлений характер. Цей бар'єр можна подола­ти, використовуючи позахромосомні молекули ДНК, здатні до автономної реплі­кації (плазміди), а також метод злиття протопластів.

У першому випадку переносниками (векторами) чужорідної ДНК у бактерійну клітину с плазміди. З цісю метою плазмідну ДНК і чужорідну ДНК обробляють відповідною рестриктазою, наприклад, Eco R І. У результаті дії цього ферменту утворюються лінійні фрагменти ДНК з одноланцюговими кінцями, що складаються з послідовностей ААТТ або ТТАА. Якщо такі фрагменти змішати, то відбудеться спарювання комплементарних основ ланцюгів плазмідноїта клітинної ДНК. Місце розривів зшивають за допомогою полінуклеотидлігази. На цьому закінчується етап створення рекомбінантної плазміди (химерної ДНК). Для проявлення гене­тичної інформації цієї ДНК її вводять у клітину шляхом трансформації. Якщо гібридна плазміда буде мати у клітині багато копій, то і чужорідна ДНК буде багаторазово копіюватись у складі плазміди.

Потомство клітини, що містить гібридну ДНК, генетично однорідне, воно утворює клон. Тому цей метод назвали клонуванням. Він дас змогу вводити у геном бактерій не тільки генетичну інформацію інших мікроорганізмів, але й генетичну інформацію з клітин вищих організмів, і одержувати білки тварин і людини (сомато-тропін, інтерферон та ін.).

Метод злиття протопластів аналогічний методу гібридизації соматичних клітин і відносно недавно застосовується для одержання мутантів мікроорганізмів. Дія цього з різних бактерій одержують протопласти й індукують їхнє злиття, оброб­ляючи поліетиленгліколем. Зі злитих протопластів після їхньої регенерації утворюються стабільні рекомбінанти, які мають властивості обох батьківських форм..

Значно полегшило одержання мутантів мікроорганізмів із бажаними для експериментатора властивостями розшифрування (секвенування, сіквенс-аналіз) їхнього генома. Нині повністю розшифровані геноми В. subtilis, Enterococcus faecalis, Е. coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Mycoplasma genita-lium, Methanococcus jannaschii та ін.