Представляю вашему вниманию выпускную квалификационную работу

ДОКЛАД

Добрый день уважаемые члены государственной аттестационной комиссии, преподаватели, одногруппники

Я, Грекова Анастасия, специальность «Лабораторная диагностика», группы 430

Представляю вашему вниманию выпускную квалификационную работу

слайд	На тему: «Бактериологическое исследование крови»
слайд	В начале ХХI века, как и в прошлые времена, сепсис продолжает оставаться одной из наиболее актуальных и сложных медико-социальных проблем. Статистика показывает, что ежегодно в мире тяжелый сепсис выявляется у 1,5 млн. пациентов, и несмотря на использование самых современных лекарственных препаратов, а также улучшение методик интенсивной терапии, летальность больных, обусловленная сепсисом, за последние 50 лет снизилась незначительно и составляет 30-80%. Актуальность данной работы в том. что у больных с клиническими проявлениями сепсиса, только в 45-48% случаев удается обнаружить бактериемию.
слайд	К данной теме была выдвинута гипотеза, что при бактериологическом исследовании крови бактерии можно обнаружить только в половине анализируемых проб.
слайд	Главная цель лабораторного бактериологического исследования крови — определить, содержит ли кровь пациента бактерии или грибы. При этом исследовании можно выявить не только возбудителя заболевания, но и определить чувствительность этого возбудителя к лекарственным средствам. А это, в свою очередь, помогает врачу подобрать эффективное лечение.
слайд	Анализ стерильности – это микробиологическое исследование, которое проводят во время наличия заболевания, которое прямо связано с попаданием в кровоток микроорганизмов. Стерильность, то есть отсутствие в крови бактерий – нормальное состояние, которое поддерживается факторами иммунной системы. А гемокультура – это культура микробов, выделенная из крови. В общем, эти два исследования носят общее название «бактериологическое исследование крови»
слайд	В каждой лаборатории, выполняющей данный анализ, осуществляют в соответствии с приказом от 22 апреля 1985 г. № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений
слайд	».В настоящее время применяются готовые флаконы с питательными средами, такие как HiCombi, HiSafe, Bactalert, Signal, VersaTREK REDOX, BD BACTEC. Работа с флаконами осуществляется согласно прилагаемым инструкциям. Идентификация возбудителя и определение чувствительности к антибиотикам могут проводиться как ручными, так и автоматизированными методами, что зависит от оснащенности лаборатории.
слайд	Самым важным и ответственным этапом бактериологического исследования является правильное взятие образца крови, свободного от контаминирующих микроорганизмов, так как контаминация образцов крови в процессе отбора приводит к значительному количеству ложноположительных результатов и может оказывать серьезное негативное воздействие на исход заболевания у пациента. Контаминация может происходить из множества источников: кожа пациента, оборудование, использованное для взятия образца, руки лица, отбиравшего образец крови, или окружающая среда. Для врача наиболее сложным при интерпретации результата гемокультивирования является решение вопроса - является ли выделенная бактерия истинным патогеном, вызвавшим инфекцию кровотока, или контаминантаминирующим микроорганизмом. Так как в настоящее время на исследование может направляться несколько комплектов с флаконами, то выявление микроорганизмов в отдельном комплекте может обоснованно рассматриваться как контаминация, не имеющая клинического значения. Следовательно, соблюдение рекомендаций по взятию крови для посева может существенно улучшить качество и клиническое значение посевов крови и снизить частоту контаминации образцов и ложноположительных результатов
слайд	Многообразие клинических проявлений сепсиса в сочетании с недостаточной определенностью самого понятия привело к его широкой терминологической трактовке. В настоящее время общепринятыми считаются определения: сепсис, тяжелый сепсис и септический шок..
слайд	В ходе проведения анализа всех случаев бактериемии с период 2000 по 2007 гг. в городской клинической больнице имени С. П. Боткина (Москва) К. П. Грувер и В. П.Белобородовым было установлено, что в более чем 60 % проб при исследовании крови на стерильность ожидать выявления бактерий не следует. По данным авторов на долю бактериальных и грибковых сепсисов, которых можно определить с помощью бактериологического метода приходиться 30,5%. Оставшаяся доля процентов приходится на не бактериальную этиологию сепсиса, так как ведущую роль в запуске ССВР могут иметь не только бактерии, а так же: Структурные компоненты бактерий (липополисахарид, тейховые кислоты, пептидогикан и другие), получаемые в результате фагоцитоза; вирусы; грибы; простейшие
слайд	При прохождении производственной практики в КОГБУЗ "Кировской городской больнице №2" в микробиологической лаборатории мне довелось принять участие и даже самостоятельно проводить некоторые этапы бактериологического исследования крови. Данный анализ в лаборатории носит название: «Кровь на гемокультуру» и «Исследование крови на стерильность»
слайд	В КОГБУЗ "КГБ №2" посев крови осуществляется во флаконы с двухфазной средой фирмы HIMEDIA, где флакон с двухфазной системой для гемокультур HiCombi предназначен для посева крови на стерильность и служит для выращивания аэробов, микроаэрофилов и факультативных анаэробов (энтеробактерий, псевдомонад, стафилококков, стрептококков, грибов Candida и так далее), второй HiSafe с двухфазной системой для сальмонелл – для посева крови на гемокультуру. От одного пациента в лабораторию может быть доставлено как два, так и один флакон. Количество флаконов, направленных на исследование, определяет лечащий врач. Так как бактериологическое исследование крови назначают во время наличия заболевания, то количество и вид флаконов подбирается в зависимости от проявления клинических симптомов. Например, при явных клинических симптомах сальмонеллеза кровь направляют лишь на гемокультуру, то есть материал доставляется в одном флаконе с двухфазной системой для сальмонелл. Флаконы с посевами доставляются в лабораторию, где им присваивается лабораторный номер, и регистрируются в электронном журнале в разделах «стерильность», «гемокультура», после чего посевы инкубируют в термостате восемь суток при температуре 37^oC. Каждые три дня посевы просматривают. Если на твердой среде имеются колонии или жидкая среда помутнела, то делают мазок по Граму, затем в зависимости от вида микроорганизма ведут соответствующее исследование. На седьмой день, если изменения среды не происходит, то из флаконов делают высевы: из флакона на стерильность материал высевают на кровяной агар, а из флакона на гемокультуру – на среду Левина. Чашки помещают в термостат на сутки при температуре 37^oC. На восьмой день, если на средах рост колоний отсутствует, то исследование прекращают и выдают отрицательный ответ, если на средах рост присутствует, то делают мазки по Граму и микроскопируют, после чего в зависимости от вида микроорганизма ведут соответствующее исследование.
13слайд	Постановка дифференциальных биохимических тестов в КОГБУЗ "КГБ №2" осуществляется с помощью системы индикаторных бумаг (СИБов). Методика выполнения: в пробирку с 500 микролитрами физиологического раствора петлей вносят культуру, затем пинцетом добавляют СИБы. Пробирки инкубируют в термостате сутки при температуре 37^oC. На следующий день по изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Постановка чувствительности к антибиотикам проводится диско-диффузионным методом. Для постановки делают сплошной посев петлей на среду АГВ. На поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками. Аппликацию дисков проводят с помощью автоматического диспансера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15 – 20 мм. Таким образом, количество антибиотиков на чашке может достигать 6. После аппликации чашки инкубируют в термостате сутки при температуре 37^oC. После инкубации чашки вынимают и оценивают задержку роста с точностью до 1 мм.
слайд	За 2015 год в микробиологическую лабораторию КОГБУЗ "Кировской городской больницы №2" для исследования было доставлено 150 флаконов с кровью, из них: 75 – кровь на гемокультуру и 75 – кровь на стерильность. Из 150 анализов положительными оказались 2 анализа крови на стерильность. Первый случай обнаружения был в апреле, где пациентом являлся мужчина хирургического отделения. При исследование был обнаружен золотистый стафилококк (S. aureus). Второй случай был зарегистрирован в мае, пациент – женщина анестезиолого-реанимационного отделения. При исследование обнаружен возбудитель эшерихиоза – Escherichia vulneris.
слайд	Пройти преддипломную практику мне довелось на базе ФГБУ «Северо-Западного федерального медицинского исследовательского центра имени В. А. Алмазова» в городе Санкт-Петербург, где бактериологическое исследование крови значительно отличается своей автоматизацией, простотой и сроками исследования.
слайд	В ФГБУ «СЗФМИЦ имени В. А. Алмазова» бактериологическое исследование крови носит название «исследование крови на стерильность». Забор крови осуществляется во флаконы Bactalert при помощи набора для взятия крови типа «бабочка». После доставленные флаконы регистрируют в журнале «кровь на стерильность». Зарегистрированные флаконы помещают в бактериологический анализатор культур крови BacT/ALERT 3D 120. Данный прибор предназначен для быстрого обнаружения бактериемии и фунгемии в гемокультурах и других стерильных жидкостях организма. В основании каждого флакона находится сенсор. Присутствующие в образце микроорганизмы во время роста на питательной среде выделяют углекислый газ, который диффундирует через избирательно проницаемую мембрану и взаимодействует с сенсором. Изменение рН в ходе этого взаимодействия приводит к смене цвета сенсора с темно-зеленого на жёлтый. Малейшее изменение цвета улавливается, преобразовывается в электрический сигнал, усиливается и передается в компьютер для анализа. После получения сообщения от прибора о положительном результате флакон вынимают из системы и производят окрашивание по Граму. Если окрашивание подтверждает положительный результат гемокультивирования, то информацию о морфологии выявленного возбудителя следует немедленно передать лечащему врачу и провести пересев для дальнейшей идентификации микроорганизма на следующие питательные среды: кровяной агар, Уриселект (хромогенный агар), Сабуро, Чистовича. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37^оС. Если окрашивание по Граму дало отрицательный результат, отчет клиницисту не направляют, если только не наблюдается рост при пересеве. На следующий день чашки вынимают из термостата и оценивают рост микроорганизмов на средах. При оценке роста на хромогенном агаре уже можно предположить вид микроорганизма по цвету. Далее производят идентификация микроорганизма с помощью масс-спектрометра MICROFLEX. Идентификация происходит в системе MALDI Biotyper. Для исследования берется единичная колония суточной культуры с кровяного агара. Колония переносится на мишень прибора. После высыхания колонии, небольшое количества раствора матрицы наносится сверху и ждут полного высыхания матрицы при комнатной температуре. Раствор матрицы способствует экстракции белков из образца. Далее мишень помещают в прибор для получения масс-спектров, затем система сопоставляет спектры с библиотекой и после чего осуществляется финальная проверка данных специалистом, который передает таблицы в ЛИС. Идентификация микроорганизма на масс-спектрометре MICROFLEX происходит в течение 20 минут. Определение чувствительности к антибиотикам проводят на автоматическом бактериологическом анализаторе MicroScan модель WalkAway 96. Для исследования берут суточную культуру и готовят инокулят (микробную суспензию) по стандарту мутности, после чего заполняют лунки панели. Для исследования используют комбинированные панели для определения чувствительности к антибиотикам, в лунках которых уже присутствуют антибиотики, и в зависимости от выделенного возбудители панели делятся на два типа: Грам – позитивные и Грам – негативные. После заполнения панелей их помещают в анализатор для проведения исследования. Количество антибиотиков на панели может достигать 32. Определение чувствительности к антибиотикам на анализаторе MicroScan занимает до 16 – 24 часов.
слайд	При прохождении преддипломной практики в ФГБУ «СЗФМИЦ имени В. А. Алмазова» мне удалось узнать как количество положительных случаев гемокультивирования, так и общее количество образцов направленных на исследование. За первый квартал в 2016 году на исследование крови на стерильность было направлено 3050 образцов крови, а количество положительных случаев гемокультивирования составило 57. Чаще всего при исследовании обнаруживались такие микроорганизмы как Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermidis.
слайд	Следовательно, выявляемость в микробиологической лаборатории ФГБУ «СЗФМИЦ им. В. А. Алмазова» за первый квартал 2016 года составила 1,86% Таким образом, можно сделать вывод, что, не смотря на метод выполнения, что в ФГБУ «СЗФМИЦ им. В. А. Алмазова», что в КОГБУЗ «КГБ №2», процент выявления положительных гемокультур очень мал. Это может быть связано как с факторами связанными бактериологическим исследованием и с факторами не связанными с бактериологическим исследованием
слайд	На основании изученных данных по данной теме можно сделать вывод, бактериологическое исследование крови – это важный метод обследования, основное применение которого – диагностика и контроль лечения пациентов с инфекциями кровотока и возможным сепсисом Изучив значение контаминации при бактериологическом посеве крови можно сказать, что взятие образца – критически важный этап процесса гемокультивирования и правильно взятый образец, свободный от контаминирующих микроорганизмов, является фактором, обеспечивающим получение точных и достоверных результатов посева крови. При изучении третьей задачи стало ясно, что в наиболее оснащенных лабораториях, таких как ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова», работа лаборанта, проводящего исследование, почти полностью автоматизирована, нежели в КОГБУЗ «Кировский городской больнице №2», что сокращает сроки выдачи результатов и работу лаборанта.
слайд	Изучив выявляемость по бактериологическому исследованию крови можно сказать, что, не зависимо от оснащенности лаборатории и количества исследуемых образцов, направленных на исследование, процент положительного гемокультивирования очень мал, тем не менее, из положительных случаев наиболее часто встречаемый возбудитель бактериемиин– это Staphylococcus aureus. При изучении научных статей стало ясно, что сепсис, может быть вызван не только бактериями, но их структурными компонентами, вирусами, грибами и простейшими. Из перечисленного при бактериологическом посеве крови, удается обнаружить только бактерии и грибы, так как данные возбудители растут на питательных средах На основании изученных мною данных цель выпускной квалификационной работы изучить значение бактериологического посева крови у пациентов с инфекцией кровотока и возможным сепсисом – выполнена, а гипотеза о том, что «при бактериологическом исследовании крови бактерии можно обнаружить только в половине анализируемых проб» - опровергнута. Содержание всей выпускной квалификационной работы может быть полезно при расширении кругозора студентов при изучении исследований на гемокультуру Спасибо за внимание, буду рада ответить на ваши вопросы!