Капсула, микрокапсула, слизь

Капсула - слизистая структура толщиной более 0,2мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при специальных методах окраски мазка (например, по Бурри-Гинсу), создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг капсулы. Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов, например, у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна, препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы).
Многие бактерии образуют микрокапсулу - слизистое образование толщиной менее 0,2мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слиэь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких границ. Слизь растворима в воде.
Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам), их еще называют гликокаликсом. Кроме синтеза
экзополисахаридов бактериями, существует и другой механизм их образования: путем действия внеклеточных ферментов бактерий на дисахариды. В результате этого образуются декстраны и леваны.

Жгутики

Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (1 пара дисков - у грамположительных и 2 пары дисков - у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик. Жгутики состоят из белка - флагеллина (от flagellum - жгутик); является Н-антигеном. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали.
Число жгутиков у бактерий различных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен жгутиков, отходящих по периметру бактерии (перитрих) у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки.

Пили

Пили (фимбрии, ворсинки) - нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10нм х 0, 3-10мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, то есть за прикрепление бактерий к поражаемой клетке, а также пили, ответственные за питание, водносолевой обмен и половые (F-пили), или конъюгационные пили. Пили многочисленны - несколько сотен на клетку. Однако, половых пилей обычно бывает 1-3 на клетку: они образуются так называемыми "мужскими" клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды (F-, R-, Col-плазмиды). Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми "мужскими" сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях.

Споры

Споры - своебразная форма покоящихся фирмикутных бактерий, т.е. бактерий
с грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высушивание, дефицит питательных веществ и др.. Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют споры, не превышающие диаметр клетки. Бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются клостридиями, например, бактерии рода Clostridium (лат. Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нильсена в красный, а вегетативная клетка в синий цвет.

Форма спор может быть овальной, шаровидной; расположение в клетке -терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулиэма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы). Спора долго сохраняется из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизмов. В благоприятных условиях споры прорастают, проходя три последовательные стадии: активация, инициация, прорастание.

2.3. Процесс спорообразования (споруляция) проходит ряд ста­дий, в течение которых часть цитоплазмы и хромосома отде­ляются, окружаясь цитоплазматической мембраной; образуется проспора, затем формируется многослойная плохо проницаемая оболочка. Спорообразование сопровождается интенсивным потреб­лением проспорой, а затем формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. После формирования всех структур спора приобретает термоустойчивость, которую свя­зывают с наличием дипиколината кальция. Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор может быть овальной, шаровидной, рас­положение в клетке — терминальное, т.е. на конце палочки (возбудитель столбняка), субтерминальное — ближе к концу палочки (возбудители ботулизма, газовой гангрены) и цент­ральное (сибиреязвенная бацилла).

Специфические элементы споры, включая многослойную обо­лочку и дипиколинат кальция обусловливают ее свойства: спора долго может сохраняться (в почве, например, возбудители си­бирской язвы и столбняка могут сохраняться десятки лет). В бла­гоприятных условиях споры прорастают, проходя три последо­вательные стадии: активацию, инициацию, вырастание. При этом из одной споры образуется одна бактерия. Активация — это го­товность к прорастанию. При температуре 60—80 °С спора ак­тивируется для прорастания. Инициация прорастания длится не­сколько минут. Стадия вырастания характеризуется быстрым ро­стом, сопровождающимся разрушением оболочки и выходом про­ростка.

3. Строение и классификация грибов

Грибы {Fungi, Mycetes) относятся к царству Fungi. Это разнородные нефотосинтезирующие (бесхлоро- фильные) эукариотические микроорганизмы.

Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с орга- неллами, цитоплазматическую мембрану и мощную клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов (ман- нанов, глюканов, целлюлозы, хитина), а также белка, липидов и др. Цитоплазматическая мембрана содержит фосфолипиды и стеролы. Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф), спле­тающихся в грибницу или мицелий.

Гифы низших грибов не имеют перегородок. У выс­ших грибов гифы разделены перегородками.

Грибы размножаются спорами — половым (телеоморфы) и бесполым (аноморфы) способами, половым путем с образова­нием гамет и других форм, а также вегетативным путем (поч­кованием или фрагментацией гиф).

Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к совершенным. Несовершенными называются грибы, у которых отсутствует или еще не описан половой путь размножения.

Бесполое размножение осуществляется с помощью эндогенных спор, созревающих внутри круглой структуры, — спорангия (рис.2.6,а) и экзогенных спор — конидий, формирующихся на кончиках плодоносящих гиф (рис.2.6,б,в). Различают два основ­ных типа конидий: артроконидии (артроспоры), или таллоко-нидии (старое название — оидии, таллоспоры), образуются путем равномерного септирования и расчленения гиф; бластоконидии образуются в результате почкования. К бесполым формам отно­сят также хламидоспоры (толстостенные клетки или комплекс мелких клеток) и склероции — многоклеточные покоящиеся органы грибов, способствующие их выживанию.

Грибы подразделяют на 7 классов: хнтридиомицеты, гифохитридиомицеты, оомицеты, тгомицеты, аскоми- цеты, базидиомицеты, дейтеромицеты.

К низшим грибам относятся: хитридиомицеты, или водные грибы, ведущие сапрофитический образ жизни или поражаю­щие водоросли; гифохитридиомицеты, имеющие сходство с хитридиомицетами и оомицетами; оомицеты — паразиты выс­ших растений и водные плесени; зигомицеты, включающие представителей рода Мисог, распространенные в почве и воздухе и способные вызывать мукоромикоз легких, головного мозга и других органов человека и животных. Половое размножение (оогамия) у зигомицетов осуществляется путем образования зигоспор, или ооспор. При бесполом размножении этих грибов на плодоносящей гифе, спорангиеносце, образуется спорангий— шаровидное утолщение с оболочкой, содержащее многочислен­ные спорангиоспоры (см. рис.2.6,а).

Высшие грибы представлены аскомицетами и базидиомице- тами (совершенными грибами), а также дейтеромицетами (не­совершенными грибами). Аскомицеты (или сумчатые грибы) имеют септированный мицелий (за исключением одноклеточ­ных дрожжей). Свое название они получили от основного органа плодоношения — сумки, или аска, содержащего 4 или 8 гап­лоидных половых спор (аскоспор). К аскомицетам относятся представители родов Aspergillus, Penicillium и др., отличающиеся особенностями формирования плодоносящих гиф. У Aspergillus (леечная плесень) на концах плодоносящих гиф, конидиенос- цах, имеются утолщения — стеригмы, на которых образуются цепочки спор — конидии. Некоторые виды аспергилл могут вызывать аспергиллезы и афлатоксикозы. Плодоносящая гифа у грибов рода Penicillium (кистевик) напоминает кисточку, так как из нее (на конидиеносце) образуются утолщения, развет­вляющиеся на более мелкие структуры — стеригмы, на которых находятся цепочки конидий. Пенициллы могут вызывать забо­левания — пенициллиозы.

Представителями аскомицетов являются и дрожжи — одно­клеточные грибы, утратившие способность к образованию ис­тинного мицелия. Дрожжи имеют овальную форму клеток с ди­аметром 3—15 мкм. Они размножаются почкованием, бинарным делением (делятся на две равные клетки) или половым путем с образованием аскоспор.

Заболевания, вызываемые некоторыми видами дрож­жей, получили название дрожжевых микозов. К ас- комицетам относится и возбудитель эрготизма (спорынья Claviceps pur­purea), паразитирующий на злаках. Многие виды аско- мицетов являются проду­центами антибиотиков, ис­пользуются в биотехноло­гии.

Базидиомицеты — шля­почные грибы с септиро- ванным мицелием. Дейте- ромицеты, несовершенные грибы (Fungi imperfecti), являются условным клас­сом грибов, который объединяет грибы с септированным ми­целием, не имеющими полового размножения. Они размножа­ются только бесполым путем, образуя конидии. К несовершен­ным грибам относятся грибы рода Candida, поражающие кожу, слизистые оболочки и внутренние органы (кандидоз). Они имеют овальную форму (рис.2.7), диаметр 2—5 мкм, делятся почкова­нием, образуют псевдогифы в виде удлиненных клеток, на концах которых находятся хламидоспоры. Эти грибы называются дрож­жеподобными в отличие от истинных дрожжей (аскомицеты), образующих аскоспоры и не имеющих псевдогиф и хламидоспор. Подавляющее большинство грибов, вызывающих заболевания у человека (микозы), относится к несовершенным грибам

4. Строение и классификация простейших

Простейшие — эукариотические одноклеточные микроорганиз­мы, составляющие подцарство Protozoa царства животных (Animalia). Простейшие включают 7 типов, из которых три типа (Sarcomastigophora, Apicomplexa, Ciliophora) имеют представите­лей, вызывающих заболевания у человека. Размеры простейших колеблются в среднем от 5 до 30 мкм.

Снаружи простейшие окружены мембраной (пелликулой) — аналогом цитоплазматической мембраны клеток животных. Они имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком, их цитоплазма состоит из эндоплазматического ретикулума, митохондрий, ли- зосом, многочисленных рибосом и др. Передвижение простей-

ших осуществляется посредством жгутиков, ресничек и путем образования псевдоподий. Некоторые простейшие имеют опор­ные фибриллы. Простейшие могут питаться в результате фаго­цитоза или образования особых структур. Многие из них при неблагоприятных условиях образуют цисты — покоящиеся ста­дии, устойчивые к изменению температуры, влажности и др. При окраске по Романовскому—Гимзе ядро простейших окра­шивается в красный, а цитоплазма — в синий цвет.

Тип Sarcomastigophora. Подтип Mastigophora (жгутиконосцы) включает следующие патогенные представители: трипаносома — возбудитель африканского трипаносомоза (сонная болезнь); лей- шмании — возбудители кожной и висцеральной форм лейшма- ниозов; трихомонады — возбудителя трихомоноза; лямблию — возбудителя лямблиоза. Эти простейшие характеризуются нали­чием жгутиков: один — у лейшманий (рис.2.8,а), 4 свободных жгутика и короткая ундулирующая мембрана — у трихомонад (рис.2.8,б). К подтипу Sarcodina (саркодовые) относится дизен­терийная амеба (рис.2.8,в) — возбудитель амебной дизентерии человека. Морфологически с ней сходна непатогенная кишечная амеба. Эти простейшие передвигаются путем образования псев­доподий, с помощью которых происходят захват и погружение в цитоплазму клеток питательных веществ. Половой путь раз-множения у амеб отсутствует. При неблагоприятных условиях они образуют цисту.

Тип Apicomplexa. В классе Sporozoa (споровики) патогенными представителями являются возбудители токсоплазмозов (рис.2.8,г), кокцидиозов, саркоцистозов, малярии (рис.2.8,д). Каждый из этих представителей имеет сложное строение и свои особенности жизненного цикла. Так, например, жизненный цикл возбуди­теля малярии характеризуется чередованием полового размноже­ния (в организме комаров Anopheles) и бесполого (в клетках тканей и эритроцитах человека, где они размножаются путем множественного деления). Токсоплазмы имеют форму полулу- ний. Человек заражается ими от животных, возбудитель может передаваться через плаценту, поражая центральную нервную систему и глаза плода.

Тип Ciliophora. Патогенным представителем является возбуди­тель балантидиаза, он поражает толстую кишку человека. Балаи- тидии подвижны, имеют многочисленные реснички.

5. Темнополъная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью пара­болоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 6, а, б).

Параболоид-конденсор имеет затемнение в центре, задерживающее централь­ные лучи света, и внутреннюю зеркальную поверхность для отражения лучей. В кардиоид-конденсоре лучи сначала отражаются от выпуклой поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, в связи с чем поле зрения остается темным. В объектив поступают отраженные от объекта лучи, которые образуют весьма характерное изображение ярко светящихся контуров микробных клеток и других частиц, находящихся в препарате на темном фоне (рис. 7).

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превра­щаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негатив- ным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособле­ние КФ-1 или КФ-4 (рис. 8). В их комплект входят:

1. Специальные объективы с фазовыми кольцами, изменяющие фазу и уменьшающие амплитуду световой волны. На оправе фазовых объективов обозначен дополнительный буквенный индекс «Ф»: Ф-10, Ф-20, Ф-40и ФОИ-90.

2. Фазовый конденсор с револьвером спепиаЛьных кольцевых диафрагм для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие для наблюдения препарата обычным методом с ирисовой диафрагмой.

3. Вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр при наблюдении за центровкой освещения.

Прн фазово-контрастной микроскопии используют осветители типа ОИ-7 или ОИ-19.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия.

Основана на явлении фотолюминесценции (рис. 9).

Люминесценция (от lumen — сеет) — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: света, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Свет люминесценции имеет ббльшую длину волны, чем свет возбуждающий, поэтому возбуждают люминесценцию коротковолновыми лу­чами. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Длина волны излучаемого света (цвет люминес­ценции) зависит от физико-химической структуры люминесцирующего вещества.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями — флюорохрома- м и. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ:'возможностью исследова­ния живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способ­ности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп

перемещения коллектора; 14 — рукоятка полевой диафрагмы; 15 — крышка гнезда свето­фильтров; 16 — винты пентрировки полевой диафрагмы; 17 — макрометрический винт; 18 — микрометрический винт; 19 - оправа коллектора; 20 — коробка с механизмами грубого и тонкого перемещения препарата; 21 — винт для крепления насадки; 22 — винты для центрировки полевой диафрагмы; 23 — бинокулярная насадка; 24 — рукоятка тормоза грубого движения; 25 — рукоятка переключения освещения; 26 — рукоятка для перемещения препарата в горизонтальной плоскости; 27 — защитная втулка; 28 ~ корпус ртутной лампы; 29 — кзовета с дистиллированной водой.

применяется для изучения вирусов, тонкого строения различ­ных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов (рис. 10). Световые лучи в таких микроскопах заменяют поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т. е. почти в 100000 раз короче длины волны видимого света. Высокая разрешающая способность электронного микро- скопа, практически составляющая 0,1-0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000 раз.

Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая способность этих приборов значительно ниже, чем у электрон­ных микроскопов «просвечивающего» типа.

Методы приготовления препаратов для тем­нопольной, фазово-контрастной и люминесцент­ной микроскопии. Для темнопольной и фазово-контраст­ной микроскопии готовят нативные препараты («раздавлен­ная» капля и др.); микроскопируют с объективом 40 или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1—1,5 мм, покровных —0,15—0,2 мм.

Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах препараты-мазки или нативные препараты, которые окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электро­нов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную метал­лическую сеточку.

5.2. Методы окраски мазков

Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Сложные методы. Включают последовательное нане­сение на препарат красителей, различающихся по химическому

составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Окраска по методу Грама. 1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолето­вого через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1—2 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в тече­ние 1—2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопи- руют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиоле­товый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 16).

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиоле­тового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в прони­цаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комп­лекс протеин — рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8:1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1:1. Изозлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при pH 2,0—ЗА У грамотрицательных — около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бак­терий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диаг­ностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии тубер­кулеза и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут ок­рашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Г раму,состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка спиртом. В первом случае грамположитеЛьные бактерии мо­гут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиоле­товым и приобретать красный цвет (характерный для грамот- рицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бакте­рии могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблю­дать технику обесцвечивания (см. п. 3 описания окраски по Г раму).

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля — Нельсена. 1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3—5 мин.

2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1—2 мин для обесцвечи­вания.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3—5 мин.

6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной

стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества ли­пидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства, а высо­кая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются при этом в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчи­вые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остают­ся окрашенными фуксином в красный цвет (рис. 17).

Окраска спор по методу Ожешки. 1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2—3 мин.

2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просуши­вают и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают препарат по Цилю — Нельсену. Споры бакте­рий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные фор­мы—синий (рис. 18).

Окраска зерен волютина по методу Нейссера. 1. На фикси­рованный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2—3 мин.

Наносят раствор Люголя на 10—30 с. Промывают препарат водой.

2. Мазок докрашивают водным раствором везувина или хризоидина в течение Я—1 мин.

3. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие

в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой ре­акцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окраши­вается в желтый цвет (рис. 19).

Обнаружение капсул по методу Бурри — Гинса. 1. Готовят препарат по Бурри: смешивают каплю взвеси микробов с кап­лей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем готовят мазок так же, как мазки из крови; затем его высу­шивают и фиксируют.

2. На мазок наносят водный раствор фуксина на 1—2 мин.

Промывают водой, высушивают на воздухе и микроско­пируют. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно­розовом фоне (рис. 20).

6. Принципы организации и оборудование бактериологической,

вирусологической и серологической лабораторий

Бактериологические, вирусологические и серологические лаборатории входят в состав санитарно-эпидемиологических станций (СЭС) и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняются бактериологические, вирусологические и серо­логические анализы материалов, полученных от больных и контактировавших с ними лиц, обследуются бактерионосители и проводятся санитарно-микробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и различных предметов.

В бактериологических и серологических лабораториях больниц проводятся диагностические исследования при кишеч­ных и гнойных инфекциях, дифтерии, туберкулезе и др., а также исследования по контролю за качеством дезинфек­ции и стерилизациа Диагностика особо опасных инфекций (чума, туляремия, бруцеллез и др.) осуществляется в специаль­ных лабораториях, организация и деятельность которых строго регламентированы.

В вирусологических лабораториях проводится диагностика заболеваний, вызванных вирусами (грипп, полиомиелит и др.), хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.). При организации и оборудовании виру­сологических лабораторий учитывается специфика работы с вирусами, клеточными культурами и куриными эмбрионами,

I ребующая строжайшей асептики.

Лаборатории обычно размещаются в нескольких помеще­ниях, которые в зависимости от объема работы и целевого назначения занимают определенную площадь. В каждой лабо­ратории предусмотрены: а) боксы для работы с отдельными группами бактерий или вирусами; б) помещения для серо­логических исследований, приготовления питательных сред, стерилизации, мойки посуды; в) виварий с боксами для здоровых и подопытных животных;, г) регистратура для при­ема и выдачи анализов. Наряду с этими помещениями в вирусологических лабораториях имеются боксы для специальной обработки исследуемого материала и для работы с клеточны­ми культурами.

Лаборатории снабжены следующим оборудованием: биологи- ' ческими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентным микроско­пом, термостатами, приборами для стерилизации (автоклав, сушильный шкаф, свертыватели), рН-мстрами, аппаратом для получения дистиллированной воды (дистиллятор), центрифуга­ми, техническими, аналитическими весами, аппаратурой для фильтрования (фильтр Зейтца и др.), водяными банями, холодильниками, аппаратом для изготовления ватно-марлевых пробок, набором инструментов (бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабораторной посудой (пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки) и др.

В лаборатории имеется место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы красок, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и пр. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и банкой с дезинфициру-ющим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна распола­гать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и дру­гими лабораторными материалами. В крупных лабораториях имеются тер­мальные комнаты для массового выра­щивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.

Аппаратура для выращивания микро­организмов, стерилизации и других микробиологических целей

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная темпера­тура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37°С. Термостаты бывают суховоздуш­ными и водяными (рис. 1). Использу­ются для культивирования микроорга­низмов.

2. Рве. 1. Термостат. 2. Микроан аэростат. Аппарат для вы­

ращивания микроорганизмов в анаэроб­ных условиях.

3. Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

4. Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под давлением (рис. 2, а, б). В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, го­ризонтальные, стационарные, переносные).

5. Холодильники. Используются в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, пита­тельных сред, кроЬи, вакцин, сывороток и прочих биологи­чески активных препаратов при температуре около 4°С. Для сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0°С исполь­зуются низкотемпературные холодильники, в которых под­держивается температура - 20°С и ниже.

6. Центрифуги. Применяются для осаждения микроорганиз­мов, эритроцитов и других клеток для разделения неоднород­ных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях исполь­зуют центрифуги, работающие на разных скоростях.

7. Прибор для счета колоний (рис. 3). Полуавтоматическийсчетчик, снабженный иглой с пружинным устройством. Лег­кий нажим иглы на участке дна чашки Петри, соответству­ющей положению колонии, оставляет на стекле метку. При этом держатель поднимается вверх, цепь замыкается и показания счетчика увеличиваются на единицу.

7. Выделение чистых культур бактерий

Объекты окружающей среды, включая и материал от больного (гной, мокрота, фекалии и др.), обычно содержат смесь раз­личных микробов. С целью их обнаружения и определения видовой принадлежности (идентификация) применяют бактериологичес­кое исследование (бактериологический метод), которое заключа­ется в посеве проб исследуемого материала на питательные среды для получения (выделения) чистой культуры.

Для выделения чистой культуры, которое производят по­этапно в течение нескольких дней, в начале его используют механическое разобщение бактерий на плотных питательных средах (посев штрихом, шпателем на несколько чашек Петри и др.). На следующий день получают отдельные изолированные колонии. Колония — скопление бактерий, ведущее начало от одной клет­ки, а поэтому представляющее собой чистую культуру.

После описания культуральных свойств различных типов колоний (размер, цвет, форма, края и др.), выросших на чашке с плотной питательной средой, делают пересев из каждого типа колоний на скошенный агар для накопления чистой культуры. Выросшую на 3-й день чистую культуру (после проверки ее чистоты путем микроскопирования) начинают идентифициро­вать по различным свойствам — морфологическим, тинктори- альным, ферментативным, антигенным и др.

Существуют способы выделения чистых культур, основанные на обработке исследуемого материала с помощью физических или химических факторов, обладающих избирательным действием на определенные бактерии. Для выделения чистых культур исполь­зуют также способность некоторых бактерий быстро размножать­ся в организме восприимчивых к ним лабораторных животных.

При выделении чистых культур анаэробов посевы исследуе­мого материала производят в анаэробных условиях на специаль­ные среды с пониженным редокс-потенциалом, а также исполь­зуют специальные аппараты (например, анаэростаты), исключа­ющие доступ свободного кислорода к растущей культуре.