Забор и обработка материала для исследования

Практическая работа № 71

Тема занятия: «Микробиологическая диагностика

Острых и хронических неспецифических

Заболеваний лёгких».

Составила преподаватель Якимова Л.М.

Минск

Практическая работа №71

Тема занятия: «Микробиологическая диагностика острых и хронических неспецифических заболеваний легких»

Цель занятия: отработать методику микробиологической диагностики острых и хронических неспецифических заболеваний легких»

Самостоятельная работа

1. Изучение схемы микробиологической диагностики острых и хронических неспецифических заболеваний легких»

2. Приготовление разведений мокроты от 10-¹ до 10^-7, посев разведений на КА, ЖСА, Сабуро, Эндо.

3. Изучение характера роста микроорганизмов на питательных средах.

4. Приготовление мазка из выросших колоний, окраска по Граму, микроскопия

Методические указания к практической работе

Инфекционные заболевания дыхательных путей и легких делят на специфические и неспецифические. К специфическим инфекциям относят туберкулез, микобактериоз, озену, склерому, коклюш, орнитоз, Ку-лихорадку, легочные формы чумы и сибирской язвы, болезнь легионеров, микоплазмоинфекции, глубокие микозы, вирусные инфекции и др. Неспецифические – протекают по типу ларингита, трахеита, бронхита, пневмонии, абсцесса, гангрены, плеврита или их сочетания. Ведущее место занимают острые и хронические бронхиты. В развитии первичных острых бронхитов и пневмоний у детей основную роль играют вирусы. Вирусная инфекция часто осложняется или сменяется микоплазменной, бактериальной (чаще стафилококки, пневмококки, инфлюенца-бактерии) или микоплазма-бактериальной. У взрослых людей острые первичные бронхиты и другие респираторные заболевания могут быть вызваны как вирусами, так и бактериями и микоплазмами. Хронические респираторные инфекции, как правило, вызываются микробными ассоциациями, в которые входят пневмококки, инфлюенца-бактерии, стафилококки, клебсиелла пневмонии, кишечная палочка, протеи и другие энтеробактерии, реже бета-гемолитические стрептококки, псевдомонады, кандиды, бактероиды. Структура возбудителей подвержена изменениям, особенно при нахождении больного в стационаре и лечении антибиотиками.

Микробиологическая диагностика

Клинический диагноз респираторных инфекций не составляет трудностей, однако для проведения антимикробной терапии необходимо знание этиологии болезни, которая не может быть установлена на основании клинических данных, так как разные возбудители могут вызывать идентичные, а один и тот же возбудитель разные клинические проявления.

Диагностика неспецифических респираторных инфекций основывается, главным образом, на выделении культуры. Дополнительные данные могут быть получены с помощью микроскопии материала и серологических реакций с аутокультурами, которые выделены в посевах высоких разведений материала.

Забор и обработка материала для исследования.

Материалом служит мокрота, промывание воды трахеи и бронхов (ПВБ), реже трахеобронхиальный экссудат (ТБЭ), взятый при бронхоскопии.

Мокроту необходимо забирать на раннем этапе болезни, до лечения химиопрепаратами, натощак. Перед сбором мокроты больному предлагают почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой. Предпочтительным является исследование утренней порции мокроты. Для забора мокроты лучше использовать одноразовые контейнеры диаметром не менее 30-35 мм. Если мокроты выделяется мало, секрецию её можно усилить ингаляцией тёплого гипертонического или щёлочного раствора, назначением бронхолитиков.

Признаки правильно собранной мокроты: гнойная зеленая; гнойная желтая; слизисто-гнойная (т.е. частично гнойная, частично слизистая); с прожилками крови; с прожилками крови и зелеными включениями.

Признаки неправильно собранной мокроты (мокроты, содержащей в основном секреты ротовой полости и глотки) - серая слизистая; серая пенистая; белая слизистая; белая пенистая; белая слизистая с частицами пищи; водянистая (т.е. присутствует лишь слюна); водянистая, с частицами пищи.

Исследование промывных вод бронхов проводят при отсутствии или скудности мокроты специально или в сочетании с лечебными процедурами. Простейший метод взятия трахеобронхиального смыва следующий: гортанным шприцем с помощью аппарата Боброва в трахею вводят около 10 мл стерильного физиологического раствора, и после возникновения кашля собирают откашлянный трахеобронхиальный смыв. У маленьких детей через катетер вводят в трахею 5-10 мл физиологического раствора и затем отсасывают трахеобронхиальный смыв. Бронхиальные смывы могут быть получены при бронхоскопии. В этом случае не рекомендуется вводить в бронх более 5 мл физиологического раствора. Браш-биоптат получают из глубины бронхов с помощью специальной канюли с защитными щёточками, что предохраняет материал от контаминации флорой верхних дыхательных путей и позволяет производить исследования на анаэробы.

Наиболее достоверные результаты достигаются при взятии материала непосредственно из очага инфильтрации или абсцесса с помощью проводимой под рентгенологическим контролем трансторокальной пункции. Отбор материала проводится в стерильный контейнер объемом не менее 1 мл (при подозрении на грибковое поражение не менее 10 мл). Образец должен быть доставлен на исследование в течение 2-х часов. Допускается хранение материала в течение 24 часов при 4-6 °С (холодильник). При антибиотикотерапии исследование проводят не ранее чем через 3 дня после отмены препарата.

Микроскопическое исследование. Из мокроты выбирают слизистый или гнойный комочек и одноразовым деревянным аппликатором наносят на середину предметного стекла в виде тонкого (чтобы можно было прочесть газетный текст на расстоянии 5-10 см) мазка площадью 1 x 2 см. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют на пламени горелки или жидким фиксатором, затем окрашивают по Граму или метиленовым синим. Для выявления друз актиномицетов или мицелия грибов можно использовать микроскопию неокрашенных мазков. При микроскопии мазка необходимо обратить внимание на наличие и характер клеточных элементов. Их выявление позволяет бактериологу проверить правильность взятия материала и составить представление о характере патологических изменений. Для воспалительных процессов в нижних отделах дыхательного тракта характерно наличие гранулоцитов. Присутствие в материале большого количества эпителиальных клеток, особенно в сочетании с отсутствием гранулоцитов, свидетельствует о том, что материал был взят неправильно (с примесью слюны). В этом случае исследование следует повторить. В соответствии с методикой Бартлетта мокрота I класса, содержащая в поле зрения (x10) более 25 эпителиальных клеток при отсутствии полиморфноядерных лейкоцитов, не исследуется. Только мокрота II (с содержанием более 25 эпителиальных клеток и более 25 полиморфноядерных лейкоцитов) и III класса (с содержанием полиморфноядерных лейкоцитов более 25 при отсутствии эпителиальных клеток) подвергаются исследованию.

Препарат мокроты исследуют под малым увеличением микроскопа (объектив ×10) не менее 20-30 полей зрения. При наличии менее 10 полиморфноядерных лейкоцитов и более 25 эпителиальных клеток культуральное исследование нецелесообразно, так как в этом случае изучаемый материал содержит примесь содержимого ротовой полости. Критерии оценки качества материала собранного из нижних отделов дыхательного тракта:

Тип клеток и их количество	Оценка
Нейтрофиллы
<10
10-25	+1
>25	+2
Присутствие слизи	+1
Эпителиальные клетки
10-25	-1
>25	-2

Суммарная оценка всех параметров 0 и менее свидетельствует о контаминации материала микрофлорой носоглотки. При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологические и тинкториальные свойства (кокки, палочки, отношение к окраске по Граму). При острой инфекции в мокроте, как правило, обнаруживают не более 1-2 типов бактерий, локализованных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы, попавшие из ротовой полости, чаще располагаются около эпителиальных клеток. При исследовании мокроты бактериоскопия мазков является обязательной, так как позволяет судить о качестве взятия мокроты и, во многих случаях, сделать заключение о предполагаемой этиологии инфекции нижних дыхательных путей.

Бактериологическое исследование. В соответствии с инструкцией по применению «Микробиологические методы исследования биологического материала» № 075-0210 от 13.03.2010г. предусмотрен посев мокроты на кровяной агар (для получения роста пневмококков после посева материала на I сектор накладывают диск с оптохином); шоколадный агар с селективной добавкой для гемофилов или кровяной агар с 2-3 сапониновыми дисками (бумажные диски диаметром 6 мм пропитывают 5% водным раствором сапонина, высушивают и хранят при 4⁰С не более месяца) и на дополнительные питательные среды: ЖСА, среду Эндо (среду Мак-Конки), среду Сабуро, анаэробный агар (только для биологического материала собранного инвазивным способом). Для выделения легионелл, бордетелл, микоплазм необходимо использовать специальные среды.

Посевы на кровяном и шоколадном агаре инкубируют - при 35-37⁰ С, 5-10% СО₂, в течение 24-48 часов, на среде Эндо (среде Мак-Конки) – при 35-37⁰ С в аэробных условиях, в течение 24 часов; ЖСА - при 35-37⁰ С в аэробных условиях, в течение 24-48 часов; среде Сабуро - при 25-30⁰ С в аэробных условиях в течение 72 часов; на анаэробном агаре - при 35-37⁰ С в анаэробных условиях в течение 7 дней. Чашки с биологическим материалом просматривают ежедневно.