Методы выявления спирохет и лептоспир

1. МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ В НАТИВНОМ ПРЕПАРАТЕ

Для исследования живых спирохет и лептоспир используется метод тёмного поля и прямая люминесцентная микроскопия.

Препараты для них готовят одинаково с небольшими различиями:

- берут 1 каплю биосубстрата (кровь, вода, соскоб из язвы и пр.), наносят на стекло;

- осторожно закрепляют покровным стеклом и устанавливают на столик темнопольного, либо люминесцентного микроскопа;

- микроскопируют с иммерсионной системой.

МИКРОСКОПИЯ В ТЕМНОМ ПОЛЕ

1. Конденсор Аббе в обычном световом микроскопе заменяют на специальный тёмнопольный. При его отсутствии модернизируют обычный. Для этого:

- из чёрной фотографической бумаги вырезают круг размером с 50 копеечную монету;

- наклеивают на середину верхней линзы конденсора строго посередине с круговым зазором для света;

- фиксируют конденсор в микроскопе.

2. Перед микроскопией на конденсор наносят каплю дистиллированной воды для предотвращения рассеивания света, но можно не наносить.

3. На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.

4. При работе с большим объектом в биоматериале можно вместо ОИ-90 использовать один из сухих объективов (*7, * 10, *20, *40), а масло заменить дистиллированной водой.

Учёт результатов. При микроскопии на тёмном фоне видны серебристые движущиеся спирохеты.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ ПРЯМАЯ МИКРОСКОПИЯ

Особенности:

При приготовлении препарата к биоматериалу для прижизненной окраски добавляют флюорохром акридин оранжевый в рабочем разведении 1:1000 и только после этого накрывают покровным стеклом. Микроскопируют в люминесцентном микроскопе МЛ-1 или МЛ-2 с набором пропускающих и запирающих фильтров для УФ-лучей.

Вместо обычного иммерсионного масла используют нелюминисцирующее иммерсионное или его заменители (репелленты - дибутилфталат, диметилфталат). Микроскопируют в затемнённом помещении.

Учёт результатов. При микроскопии жизнеспособные клетки двигаются, имеют чаще зелёное свечение, нежизнеспособные и умирающие - оранжевые и обездвижены. Оба метода особенно удобны при обнаружении лептоспир, которые невозможно окрасить.

Приложение 2

ОКРАСКА СПИРОХЕТ В ЧИСТОМ ВИДЕ И В БИОМАТЕРИАЛЕ

1. ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ - ГИМЗЕ

Техника окраски:

1) Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором красителя, который готовят непосредственно перед использованием (к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 10 капель красителя Романовского – Гимзы, коммерческого).

2) Через час краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе, исследуют при иммерсии.

Оценка результата. Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубовато-синий, ядра – в фиолетовый красный.

При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый.

Примечание: если краситель спиртовой, то мазок не фиксируется.

2.Серебрение по Морозову.

3. Окраска по Граму.

4. Обработка по Бурри.

Таблица 1

Выбор методов индикации различных структурных элементов и определение некоторых микроорганизмов

Метод посева

Леффлера

Романовского-Гимзе

Плазмолиз с генцианвиолетом

Морозова

Ожешко

Нейссера

Фельгена

Метод Грама

Структурные элементы и виды

Ядро и нуклеоид

Оболочка

Зёрна волютина

Капсула

Подвижность (жгутики)

Споры

Бактерии, имеющие и не имеющие Mg, Ca, соли

Простейшие

Риккетсии

Грибы а) дрожжи б) лучистые в) нитчатые

Спирохеты

Микоплазмы

Вирусы