СОДЕРЖАНИЕ.
1. Введение………………………………………………………………………3
2. Ветеринарная фармакология………………………………………………...5
2.1. Организация работы ветеринарной аптеки…………………………….5
2.2. Структура, правила составления и выписывания рецептуры………...8
2.3. Изготовление наиболее распространенных лекарственных форм, применяемых в ветеринарии………………………………………………...9
2.4. Хранение лекарственных препаратов…………………………………12
3. Клиническая диагностика………………………………………………….13
4. Оперативная хирургия……………………………………………………...14
4.1. Фиксация животных. Повал. Подготовка к операции……………….14
4.2. Премедикация и анестезия…………………………………………….20
4.3. Разъединение тканей, наложение швов, десмургия………………….21
4.4. Остановка кровотечений и профилактика хирургических инфекций…………………………………………………………………….22
5. Ветеринарная микробиология и микология………………………………24
5.1. Ознакомление с помещением и оборудованием ветеринарной лаборатории. Техника безопасности. Документация.…………………….24
5.2. Способы взятия патологического материала от животного. Методы консервирования, упаковки и транспортировки патологического материала для бактериологического исследования. Сопроводительная документация………………………………………………………………..25
5.3. Освоение микроскопических методов исследования………………..30
5.4. Проведение лабораторного анализа патологического материала на наличие возбудителя инфекции…………………………………..………..33
6. Вирусология и биотехнология……………………………………………..36
6.1. Проведение вирусологического анализа патологического материала…………………………………………………………………….36
6.2. Проведение серологического анализа………………………………...39
6.3. Кормление и уход за лабораторными животными. Биопроба………41
6.4. Биопрепараты. Способы хранения и утиллизации…………………...42
ВВЕДЕНИЕ.
Я проходила свою летнюю учебно-производственную практику в ООО «Интенсив», располагающемся в поселке Авангард, Чучковского района, Рязанской области. До места можно добраться железнодорожным (на электропоезде «Рязань 1» – «Сасово» 2,5 часа до станции «Ункосово») или автомобильным транспортом.
Хозяйство располагается в восточной части области, где преобладает умеренный климат и основным видом почв является чернозём.
В районе в целом заметен хороший уровень сельского хозяйства: поля ухожены и засеяны различными культурами, повсюду встречается сельскохозяйственная техника.
Сам комплекс в целом выглядит хорошо. Видно, что здания возведены в последние несколько лет, за исключение двух скотных дворов, где содержатся нетели и стельные коровы. Территория огорожена, на въезде находится КПП с дезинфицирующей ямой и вдоль всех дворов проложена асфальтированная дорога. Как было сказано выше, первый двор – нетели, второй – стельные коровы и есть ещё 3 двора, в одном из которых содержатся телята,а в двух других – 1200 голов дойных коров. Родильное, лечебное и доильное отделения находятся в переходе между двумя этими дворами. В этом же переходе оборудованы помещения для работы (аптека, осеменаторская и операторская) и отдыха (обеденная, душевая и раздевалка) персонала.
Главным ветеринарным врачом ООО «Интенсив» является Володарский Николай Владимирович (стаж с 2003 года). В штат сотрудников входят 2 ветеринарных врача и 2 техника по искусственному осеменению.
Рабочий день ветеринарного врача обычно начинается в 7, реже в 5 часов утра и заканчивается в 5 (±2) часов вечера, в зависимости от количества работы. Утром проводится осмотр всего дойного стада, выявляются слабые и больные животные, и при наличии таковых их перегоняют (перевозят) в лечебное отделение. Затем производятся осмотр и профилактическое лечение телят. Все эти манипуляции обычно длятся до 10 часов утра. По возможности, до прихода на дойку маститной группы, проводятся работы в родильном отделении. Примерно в 12 часов лечится мастит. В промежутках между этими основными элементами может производиться контроль погрузки выбракованных животных для перевозки на мясокомбинат или трупов – для перевозки на предприятие по их переработке, берутся пробы на различные исследования и, естественно, врач может прекратить любое профилактическое мероприятие при возникновении каких-либо серьезных сложностей у животных (падения, удушения в хэд-локах и т.д.). При массовой вакцинации задействуются 1-2 врача и по времени это может занять весь рабочий день.
Ветеринарная фармакология
Учебный элемент 1: «Организация ветеринарной аптеки»
Антибиотики:
1.Ресфлор - лекарственное средство в форме раствора для инъекций, предназначенное для лечения болезней бактериальной этиологии и купирования воспалительных процессов у крупного рогатого скота.Ресфлор в качестве действующего вещества в 1 cм3 содержит 27,4мг флуниксина меглумина (что соответствует 16,5мг флуниксина) и 300мг флорфеникола, а в качестве вспомогательных веществ—N-метил-2-пирролидон, пропиленгликоль, ангидрид лимонной кислоты и полиэтиленгликоль.
Применяли в комплексе с инфузией для лечения бронхопневмоний телят(10 мл на теленка п/к,1 раз в 48 ч.)
2.Спировет — инъекционный раствор спирамицина 600 000 МЕ в 1 мл,применяли по 3 мл на теленка в/м в комплексной терапии диспепсии.
3.Нитокс 200 - инъекционный пролонгированный раствор,содержащий в 1 мл 200 мг окситетрациклина дигидрата в комплексном растворителе магния оксида, ронгалита и моноэтаноламина.Вводили по 50 мл на голову(из расчета 10 мл на 100 кг) при заболеваниях неясной этиологии.
4.Ниокситил - в состав суспензии входит тилозина тартрат, окситетрациклина гидрохлорид, нитроксалин. «Ниокситил» оказывают сильное антимикробное действие на широкий спектр грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включая анаэробы и грибы.
Применяли по 50 мл на голову внутриматочно при эндометритах.
5.Мастиет Форте —суспензия, выпускается в шприцах для интрацистерального введения. Один шприц-дозатор в качестве действующих веществ содержит: 200 мг тетрациклина (в форме гидрохлорида), 250 мг неомицина (в форме сульфата), 2000 ME бацитрацина и 10 мг преднизолона, в качестве вспомогательных веществ — 368 мг стеарата магния и до 8 г вазелинового масла.Применяли для лечения маститов.
6.Ветбицин 5 - бензатина бензилпенициллин — 1 200 000 ЕД и бензилпенициллина новокаиновая соль — 300 000 ЕД (аналог медицинского Бициллина-5) Применяли при лечении пупочного сепсиса телят:обкалывали пупочную область 20 мл раствора Ветбицина-5 на 100 мл 0,5% новокаине)
7.Тиоцефур -порошок для инъекций+растворитель, содержит в качестве действующего вещества цефалоспориновый антибиотик цефтиофур натрия. Применяли по 20 мл на голову для жаропонижения и как противовоспалительное при храмоте и заболеваниях копыт.
8.Стрептофур-раствор для внутриматочного введения содержит в 1 мл в качестве действующих веществ стрептоцид 100 мг и фурагин 0,5 мг. Не применяли.
Витаминно-аминокислотные комплексы:
1.Элеовит — комплексный витаминный препарат. Применяли для профилактики гиповитаминозов новотельным коровам и коровам с повреждениями копыт в комплексе с Тиоцефуром в дозе 20 мл на голову.
2.Витам — комплексный витаминный препарат. Вводили п/к по 50 мл на теленка для профилактики гиповитаминозов у телят при диспепсии
3.Метаболаза — аминокислотный комплекс для ослабленных животных. Применяли в комплексной терапии диспепсии телят:100 мл на голову
Гормональные средства:
1.Окситоцин — синтетический гормональный препарат, повышает возбудимость и усиливает сократительные свойства мускулатуры матки и увеличивает выработку передней долей гипофиза лактогенного гормона —пролактина. Применяли новотельным коровам в дозе 20 мл на голову (1 мл-10 ЕД!)
2.Оксилат - применяли в дозе 20 мл на голову при задержке последа свыше суток от отела
3.Эстрофан - лекарственное средство в форме инъекционного раствора для лечения и регуляции воспроизводительной функции у самок сельскохозяйственных животных.
Маточные средства:
1.Йодопен-лекарственное средство в форме суппозиториев, предназначенное для лечения и профилактики послеродовых эндометритов (не применяли)
2.Внутриматочные палочки с ихтиолом — лс для купирования воспалительных процессов(не применяли)
НПВС:
1.Флунекс -относится к группе нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов,в 1 мл содержит флуниксин меглумин – 83 мг.Применяли в качестве обезболивающего 30мл на корову(не более 5 мл в 1 место инъекции)
2.Флексопрофен - нестероидное противовоспалительное лекарственное средство в форме раствора для инъекций, применяемое для лечения воспалительных заболеваний опорно-двигательного аппарата и в качестве обезболивающего и жаропонижающего средства (не применяли)
Растворы для инфузий:
1.Изотонический раствор натрия хлорида 0,9%
2.Раствор Рингера-Локка
3.Глюкоза 40%
4.Кальция хлорид
5.Раствор кальция борглюконата
Биопрепараты:
1.Инфорс
2.ВанШотУльтра
3.Байкокс 5%
4.Сыворотка «Иммуносерум»
Учебный элемент 2:
«Структура,правила составления,выписывания рецептуры»
1.Теленок,60 кг,7 дней,бронхопневмония
Rp.: Resflori 10 ml
D.t.d.N. 1
S.Подкожно,по 5 мл в одно место
2.Теленок,3 дня,40 кг,диспепсия
Rp.:«Спировет» 3ml
D.t.d.N. 1
S.теленку по 3 мл внутримышечно однократно
3.Теленок,3 дня,40 кг,снижение резистентности
Rp.: «Иммуносерум» 60ml
D.t.d.N. 1
S.теленку по 60 мл внутримышечно
4.Задержка последа у коровы,400 кг
Rp.: Oxylati 20 ml
D.t.d.N 1
S. Внутримышечно,при задержке последа по 20 мл на корову
5.Эстрофан корове 400кг для синхронизации полового цикла
Rp.: Oestrophani 3 ml
D.t.d.N 1
S. Внутримышечно,по 3 мл на голову для синхронизации полового цикла у коров
6.Обезболивающее корове,400-500кг
Rp.:Flunex 30 ml
D.t.d.N 1
S. Внутримышечно по 30 мл на корову(в одно место-не более 5 мл)
7. Корова,400 кг,повреждение копыта
Rp.:«Тиоцефур» 20 ml
D.t.d.N 1
S. Внутримышечно по 20 мл на корову
8.Теленок,7 дней,60 кг,авитаминоз в следствии диспепсии
Rp.: Eleoviti 2 ml
D.t.d.N 1
S.Внутримышечно по 2 мл
9.Корова, 3,2 года, 520 кг, мастит 4 соска.
R.p.: Mastiet Forte
D.t.d.N 4
S.Внутрицистернальное, однократно. Вводить по 1 шприцу в каждый сосок. При необходимости повторить процедуру через 24 часа.
10.Нетель, 16 месяцев, 460 кг, язва копыта.
Rp.: Ung. Ichtyoli 10% - 10,0
D.s. Наружное, наложение повязки с ихтиоловой мазью на пораженный участок.
Учебный элемент 3: «Изготовление наиболее распространенных лекарственных форм,применяемых в ветеринарии»
В нашем хозяйстве не изготавливают лекарственные средства, но данная процедура должна проходить следующим образом:
1.Жидкие лс. При изготовлении жидких лекарственных форм с водной дисперсионной средой в первую очередь отмеривают рассчитанный объем воды (очищенной, для инъекций или ароматной), в котором последовательно растворяют твердые лекарственные и вспомогательные вещества с учетом растворимости и возможного их взаимодействия.
Первыми в отмеренном объеме воды растворяют ядовитые и наркотические вещества (список А), затем наркотические и сильнодействующие (список Б), а далее несильно действующие с учетом их растворимости.
Для повышения растворимости веществ умеренно, мало или медленно растворимых их предварительно измельчают, а в процессе изготовления их растворы нагревают с учетом физико-химических свойств и перемешивают.
При изготовлении растворов очень мало растворимых или практически нерастворимых веществ, кроме вышеперечисленных операций используют получение растворимых производных (комплексообразование, образование растворимых солей) и солюбилизацию в соответствии с нормативной документацией.
Изготовленный раствор фильтруют через фильтр, материал которого подбирают с учетом физико-химических свойств веществ и назначения раствора.
Твердые лекарственные вещества в состав лекарственной формы могут быть введены в виде заранее изготовленных концентрированных растворов, которые добавляются после растворения твердых веществ и фильтрования раствора
Если в состав лекарственной формы входят другие жидкие лекарственные средства, их добавляют к водному раствору в следующей последовательности:
- водные нелетучие и непахучие жидкости,
- иные нелетучие жидкости, смешивающиеся с водой,
- водные летучие жидкости,
- жидкости, содержащие спирт, в порядке возрастания его концентрации
- летучие и пахучие жидкости.
При добавлении всех жидкостей также следует учитывать их принадлежность к определенному списку, растворимость и способность смешиваться с водой.
При изготовлении растворов в вязких и летучих растворителях непосредственно в сухой флакон для отпуска дозируют лекарственное средство или вещество, вспомогательные вещества, затем взвешивают растворитель (спирт отмеривают).
При использовании вязких растворителей (глицерин, масла) применяют нагревание с учетом физико-химических свойств лекарственных веществ.
При растворении в спирте или хлороформе - нагревают только в случае необходимости и с соблюдением мер предосторожности.
Растворы, содержащие летучие вещества, нагревают при температуре не более 40 - 45° C.
Не нагревают жидкости, содержащие эфир и его смеси со спиртом.
Растворы фильтруют через сухой фильтрующий материал, который подбирают с учетом вязкости и летучести растворителя, соблюдая меры предосторожности для снижения потерь, связанных с испарением.
2.Мягкие лс на примере мази.
Первым этапом в приготовлении мазей служит выбор основы (ланолин и вазелин). Следующий этап-подготовка лекарственного сырья для ввода в мазевую основу, в это время лекарственные вещества измельчают, просеивают через сито с определенным диаметром отверстий (если они входят в мазь по типу суспензии) или растворяют в воде или подходящем компоненте мазевой основы (если это мазь-эмульсия или мазь-раствор)
Далее идет непосредственно введение лекарственных веществ в мазевую основу. При этом надо обратить внимание на следующие факторы:
· степень дисперсности лекарственных веществ;
· их равномерное распределение по всей массе основы;
· способ введения лекарственных веществ в основу;
· время, скорость и порядок смешивания компонентов;
· температурный режим и др.
Лекарственные вещества вводят в мази с учетом их количества и физико-химических свойств. Они бывают трех типов:
· растворимые в основе;
· легко растворимые в воде;
· нерастворимые ни в основе, ни в воде.
Добавление лв происходит при постоянном перемешивании.
Учебный элемент 4: «Хранение лекарственных препаратов»
Биопрепараты (сыворотки, вакцины) на комплексе хранились в холодильнике, все остальные - в помещении аптеки.
Клиническая диагностика
Этапный эпикриз
1. Теленок бирка 12311, дата рождения 28.07.2014
2. Дата поступления 2.08.2014
3. Анамнестические данные: животное слабое, аппетит отсутствует, диарея, кашель
4. Результаты клинического осмотра: животное истощено, кашель, при аускультации трахеи - на всем протяжении сильный хрип. На основании этих признаков был поставлен диагноз
5. Лечение: Ресфлор по 10 мл, инфузия кальций борглюконат 200 мл, элеовит 2 мл.
6. При осмотре 4.08.2014 заметны улучшения - отсутствие кашля, появление аппетита.
7. Исход-выздоровление.
На мой взгляд, лечение подобрано рационально: назначение антибиотика в данном случае уместно, т.к. бронхопневмания телят имеет преимущественно бактериальное начало, инфузия кальция восполняет его в организме, т.к. наблюдалась диарея, ввод витаминов тоже не является лишним, т.к. пневмонии могут наступать при нехватке витамина А, т.е. при неправильном(несбалансированном) кормлении телят и, как следствие, диареи и гиповитаминоза - снижение иммунитета и проявление данного заболевания.
Оперативная хирургия
Учебный элемент 1: «Фиксация животных.Повал.Подготовка к операции»
В основном в хозяйстве фиксация осуществлялась в станке.Других способов фиксации и повалов-не использовалось.Операций не проводилось.
1.Фиксация и повал крупного рогатого скота. У крупного рогатого скота большинство лечебных и диагностических приемов проводят на животных, фиксированных в стоячем положении. К повалу животных прибегают при операциях на копыте, конечностях и органах брюшной полости.
Фиксация в стоячем положении. Одним из наиболее простых способов фиксации и успокоения крупного рогатого скота является сдавливание носовой перегородки большим и указательным пальцами руки. Для этого одной рукой захватывают ближайший рог, а другой сдавливают носовую перегородку. Более надежно и удобнее сдавливать носовую перегородку носовыми щипцами Гармса, Соловьева и др.
Злым быкам-производителям с целью их усмирения обычно вставляют в носовую перегородку постоянные металлические кольца, состоящие из двух полуколец, соединенных шарниром. Одна половина кольца имеет заостренный конец, которым прокалывают носовую перегородку.
В носовую перегородку специальными щипцами или троакаром. Носовую перегородку при этом прокалывают в нижней бесхрящевой ее части таким образом, чтобы кольцо выступало из носовой полости только на одну треть своей величины и тем самым не мешало животному принимать корм.
Для надежной фиксации голову животного можно привязать веревками к столбу, захватывая рога и нижнюю часть морды.
Грудную конечность фиксируют наложением на предплечье закрутки, состоящей из веревочной петли и палки; иногда конечность сгибают в запястном суставе и удерживают ее за веревку, закрепленную за предплечье, и пясть.
Тазовые конечности можно фиксировать веревочной петлей, стягивая обе конечности выше заплюсневого сустава, закруткой на голень, укреплением конечности на палке и хвостом, обводя его вокруг голени с внутренней стороны на наружную на уровне коленного сустава.
Для фиксации животных в стоячем положении также широко пользуются станками самой различной конструкции.
Фиксация крупного рогатого скота в лежачем положении. С этой целью используют один из следующих способов повала.
Способ Гесса. Берут длинную (6--8 м) прочную веревку и подвижной петлей закрепляют ее вокруг основания рогов. Затем веревку направляют назад по верхней части боковой поверхности шеи и туловища по стороне, противоположной той, на которую хотят повалить животное, и на уровне заднего угла лопатки веревку обводят затягивающейся петлей вокруг грудной клетки. Отсюда веревку снова направляют назад до голодной ямки, где накладывают вторую такую же петлю.
Оставшийся свободный конец веревки должен быть длиной не менее 1,5--2м, чтобы за него было удобно валить животное.
Валят животное три человека: один из них держит животное за голову, наклоняя ее вниз, а двое других медленно тянут конец веревки назад. Сдавливаемое веревкой животное подгибает конечности и плавно ложится.
Чтобы повалить животное в желаемую сторону, его толкают в маклок и запрокидывают голову или тянут за хвост в ту сторону, куда хотят повалить животное. После повала веревку не ослабляют до тех пор, пока не будут связаны конечности.
Итальянский способ. Длинную веревку складывают вдвое и серединой набрасывают на шею животного сверху, концы ее пропускают между грудными конечностями, выводят наверх, скрещивают на пояснице и выводят назад между тазовыми конечностями. Концы веревки тянут назад и в сторону повала. Животное держат за голову и наклоняют вниз. Можно также потянуть и за хвост в сторону повала. Животное медленно ложится. Концы веревок освобождают от натяжения только после фиксации конечностей.
Датский способ. Обе грудные конечности связывают короткой веревкой в области пута. Берут две длинные веревки, концы которых закрепляют по отдельности на путовой области каждой тазовой конечности. Свободные концы веревок проводят между грудными конечностями через веревку снизу вперед и назад. При повале концы веревок тянут назад и в сторону, противоположную повалу. Конечности у животного сближаются и оно ложится
Кавказский способ. Для повала необходимы две веревки. Веревку длиной 2,5 м накладывают в области таза и на брюшную стенку животного так, чтобы она проходила в зависимости от стороны, на которую валят, спереди левого и позади правого маклока или наоборот. Свободные концы веревки связывают узлом в области левой голодной ямки. Другую веревку длиной не менее 3 м прикрепляют к левому рогу, обвивают ею челюсти животного в виде петли, а свободный конец веревки направляют по левой стороне туловища назад, пропускают изнутри наружу под первую веревку и перебрасывают через спину на противоположную сторону.
2.Подготовка к операции
Подготовка рук хирурга
Кожа рук содержит большое количество различных микробов не только на поверхности, но и в порах, многочисленных складках, волосяных мешочках, потовых и сальных протоках. Особенно их много находится под мо золями. При выделении сала и пота микробы выходят на поверхность кожи из глубоких слоев, так что уже вымытые и подготовленные руки могут самоинфицироваться. Подготовку рук начинают за 10-15 мин до операции. Вначале их очищают механически: коротко подрезают ногти, удаляют заусенцы, очищают подногтевые пространства (маникюр не допускается). Затем 3-4 мин руки моют теплой водой с мылом щетками или салфеткой. Для мытья рук можно пользоваться жидким (зеленым) мылом, которые хорошо пенятся, растворяют кожный жир, легко смываются и не портят кожу. Руки моют методично и последовательно: сначала моют кисти и нижнюю часть ладони и тыльные стороны кистей. При этом происходит очищение рук от грязи, кожного сала, слущенного эпидермиса вместе с находящейся в них микрофлорой. После мытья руки вытирают насухо стерильным полотенцем, начиная с кисти и заканчивая предплечьем. Затем кожу рук обрабатывают 3 мин, обтирая стерильным марлевым шариком, пропитанным одним из антисептических растворов: этиловым спиртом, йодированным спиртом 1: 1000, диоцидом 1: 3000, 1 %-ным раствором дегмицида, 0,1 %-ным раствором химозола. После обработки рук антисептическими растворами обязательно нужно смазать подногтевые пространства 5%-ным спиртовым раствором йода. Обработка рук антисептическими средствами не обеспечивает их стерильность. Поэтому операцию необходимо проводить в стерильных резиновых хирургических перчатках.
Стерилизация белья, перевязочного и шовного материала
Перевязочный материал и хирургическое белье должно стерилизоваться только в автоклавах под давлением около 2х атмосфер. Лишь в чрезвычайных случаях, когда нет иного выхода, применяют стерилизацию текучим паром. Все автоклавы должны находятся под строгим контролем Гостехнадзора, которые обязаны не реже 2 раз в течении 12 месяцев производить осмотр прибора, и составлять санитарно-гигиенический акт, в котором содержатся сведения о исправности или неисправности прибора, даты последней проверки, замечания которые необходимо устранить и опломбируют его манометр. На любой автоклав обязательно должен быть индивидуальный паспорт. Приказом по лечебным учреждениям должен быть назначен работник, который несет ответственность за корректную и безопасную работу автоклавов, помимо этого осуществляет их плановый осмор и ремонт. Стерилизацию необходимо проводить в специальной выделенной для этих целей комнате. В данном помещении должна постоянно соблюдаться идеальная чистота, при этом законодательством запрещается использование этой комнаты для иных целей. В автоклавной находится журнал в котором ведутся записи всех стерилизаций перевязочного материала, белья, а также на стене должна быть вывешана инструкция по правильной эксплуатации прибора. Стерилизация перчаток должна производиться в автоклаве только в отдельном отсеке. Перед стерилизацией их тщательно посыпают тальком как внутри так и снаружи и обворачивают стерильной салфеткой, это делается для того чтобы избежать слипания перчаток друг с другом. Кипячение перчаток не целесообразно, так как кипячение очень сильно портит резину, что ограничивает сроки эксплуатации. В случае соприкосновения перчаток или иных материалов с гноем, или прочими сильно инфицированными средами, их обязательно следуют погрузить на ночь в стерилизационный раствор. Так же иногда возникает необходимость иметь раздельные наборы перчаток для гнойный и чистых операций.
Подготовка операционного поля. Это важное звено в профилактике раневой инфекции состоит из двух основных моментов - механической очистки кожи области операции и дезинфекции.
Механическая очистка. В оперируемой области выстригают и выбривают волосяной по кров, затем мягкой щеткой или марлевой салфеткой обмывают кожу теплой водой с мылом и насухо вытирают чистым полотенцем. Во время механической очистки с поверхности кожи удаляют чешуйки эпидермиса, грязь с секретами потовых и сальных желез, а вместе с ними большое количество различной микрофлоры.
Дезинфекция операционного поля. Кожу наиболее часто дезинфицируют двукратным смазыванием операционного поля 5%-ным спиртовым раствором йода (по Филончикову). Этот препарат хорошо растворяет кожное сало и глубоко проникает в кожу, воздействуя на микроорганизмы, находящиеся как на поверхности, так и в толще ее. Раствор йода наносят на сухую кожу, так как в присутствии влаги он действует слабее. Первую обработку делают перед местным обезболиванием, вторую - непосредственно перед разрезом кожи. Пользуются при этом стерильной ватой, намотанной на палочки, ватными или марлевыми тампонами, удерживаемыми пинцетом или тампонодержателем. Обработку начинают с центра операционного поля концентрическими кругами или параллельными полосами. Дезинфекцию операционного поля можно проводить 5-10%-ным раствором перманганата калия, 0,5%-ным раствором аятина, 1 %-ным раствором йодопирона. После дезинфекции операционное поле изолируют от окружающих участков кожного покрова стерильны ми салфетками или специальной простыней с прорезью в центре для оперируемой области. Простыню фиксируют к коже за края прорези цапками или редким узловым швом. Желательно употреблять большие простыни, которыми покрывают тело животного или большую часть его. Это исключает попадание в рану волос, перхоти, пыли и т.п. с отдельных участков кожного покрова при некоторых движениях животного во время операции.
Стерилизация хирургического инструмента. Очищенные от смазки инструменты разбирают, режущие их части обвертывают марлей, затем погружают в 2%-ный кипящий раствор натрия гндрокарбопата или 0,25%-лый раствор натрия гидроокиси и кипятят в течение 10-15 мин. При стерилизации инструмента, загрязненного гноем, его вначале моют, а затем кипятят не менее 30 мин в указанном растворе, добавляя к нему 0,5% медицинского лизола. Шприцы стерилизуют в разобранном виде, погружая их в холодную дистиллированную (или профильтрованную кипяченую) воду, затем доводят раствор до кипения и выдерживают 30 мин. Таким же путем стерилизуют инъекционные иглы, стеклянные и резиновые предметы. Стерилизация резиновых перчаток и жгутов. Перчатки и жгуты стерилизуют в автоклаве, или кипячением в воде в течение 15- 30 мин, или погружением в раствор диоцида 1:3000 на 30 мин. Стерилизация перевязочного материала и хирургического белья. Перевязочный материал (марлевые салфетки, бинты, вата, тампоны) и хирургическое белье (халаты, полотенца, простыни и др.) стерилизуют в автоклаве при давлении 1,5 ат в течение 30 мин, при дав-, лении 2 ат - 20 мин. Слегка смоченное белье можно простерилизовать утюжением. Однако этот метод не обеспечивает достаточной стерильности. Стерилизация шелка и ниток. Шелк стерилизуют по одному из следующих способов. 1. Мотки шелка выдерживают в течение 12 ч в эфире, затем 12 ч в спирте. Далее кипятят в течение 5-10 мин в 0,1%-ном растворе сулемы, хранят в 0,1%-ном растворе сулемы. Перед употреблением кипячение в сулеме повторяют. 2. Мотки шелка моют в течение 2 мин в горячей воде с мылом, хорошо прополаскивают, наматывают на шлифованные предметные стекла или стеклянные трубочки, затем погружают на 15 мин, в 0,5%-ный раствор нашатырного спирта, после чего перемещают на 15 мин в 2%-ный раствор формалина в 70%-ном этиловом спирте. Синтетические нити (капроновые, лавсановые и др.) стерилизуют кипячением в течение 20 мин. Шелковые нити можно стерилизовать в автоклаве так же, как перевязочный материал.
Учебный элемент 2: «Премедикация и анестезия»
Премедикация:
Животное начинают готовить к операции. Очень важным этапом подготовки является премедикация, когда вводят специальные лекарства, которые улучшают работу сердца и легких во время наркоза, препятствуют развитию аллергических и других нежелательных реакций.Основная задача премедикации: оказание седативного и потенциирующего эффектов, торможение рефлекторных реакций, снижение секреции слизистых верхних дыхательных путей и желудка. Для подавления вагуса и снижениния солевации вводят 0,1% раствор атропина сульфата, для профилактики анафилактического синдрома-димедрол.
Анестезия:
Для наркоза крупного рогатого скота я бы использовала
ксилозиновый наркоз: Во время введения животное необходимо зафиксировать и ввести внутримышечно:
1. 0,25 мл на 100 кг для успокоения и проведения малых хирургических вмешательст
2. 0,5 мл на 100 кг для успокоения средней степени и проведение небольших хирургических манипуляций. При этом животное стоит
3. 1 мл на 100 кг для сильного успокоения с интенсивной продолжительной мышечной релаксацией и выраженной аналгезией при проведении хирургических вмешательств на лежачем животном.
4. 1,5 мл на 100 кг в исключительных случаях при весьма болезненных и продолжительных операциях
Учебный элемент 3: «Разъединение ткани, наложение швов и десмургия»
В нашем хозяйстве не проводились хирургические вмешательства, но разъединение тканей должно было бы проходить следующим образом:
для разъединения мягких тканей прибегают к разрезам с помощью острых инструментов. Основными инструментами в хирургии являются хирургический нож (скальпель) и ножницы. Большинство разрезов делают брюшистым скальпелем. При всех разрезах необходимо придерживаться послойного разъединения тканей. Мышцы разъединяют по ходу волокон. Длина разреза зависит от пораженного участка и глубины проникновения в ткани, но разрез должен быть минимальным, насколько это возможно. Форма разреза чаще всего бывает прямолинейной, а при иссечении язв и свищей – веретенообразной. Ножницами пользуются для разъединения тканей в глубине раны, при операциях на полых органах (матка, желудок, кишки), при наложении лигатур. Для разъединения костей применяют листовые и проволочные пилы. Костными ножницами производят резекцию ребер. Надкостницу отделяют распатором. Особый вид разъединения тканей — трепанация, которая осуществляется выпиливанием в костях отверстий цилиндрическими пилами, шаровидными фрезами, костными долотами. Прежде чем провести такую операцию, необходимо подготовить операционное поле — сделать угловой разрез кожи и других тканей; после обнажения кости по форме раны рассечь надкостницу и отодвинуть ее распатором к основанию кожного лоскута. Далее можно приступать непосредственно к операции. Ампутация — полное разъединение тканей с удалением периферической части органа. Операция проводится на костях и на любых паренхиматозных органах. Ампутацию выполняют с лечебной целью сохранения жизни и хозяйственной ценности животного (матки, вымени, полового члена, фаланг пальцев у парнокопытных, конечностей у мелких животных). Для облегчения ухода за животными и их эксплуатации возможна ампутация рогов у крупного рогатого скота, также сюда относится вскрытие абсцессов, свищей, удаление опухолей.
Учебный элемент 4: «Остановка кровотечения и профилактика хирургической инфекции»
Способы остановки кровотечения:
1.Временная (провизорная) остановка кровотечения осуществляется:
прижатием пальцем или рукой кровоточащего сосуда к кости в определенном для каждого сосуда месте
при кровотечениях из сосудов конечностей или хвоста налоением жгута Эсмарха не более чем на 1,5-2 ч либо тугой тампонадой кровоточащей раны
2.Окончательная (дефинитивная)остановка кровотечения осуществляется несколькими способами:
Механический способ: тампонада, наложение гемостатических зажимов, торзирование сосудов, перевязка кровоточащего сосуда и т. д.
Химический способ: используют гемостатики местного и общего действия.К первым относятся:3% раствор пероксида водорода, перманганат калия в разведении 1:500, алзол, антипирин и т.д. К гемостатикам общего действия:10% раствор кальция хлорида при внутривенном введении, адреналин в растворе 1:1000 также внутривенно,2-5% раствор эфедрина и др.
Физический способ: воздействие высокой и низкой температуры, электронож.
Биологический способ: тканевая тампонада, использование тромбина, витамина К и т.д.
5. Ветеринарная микробиология и микология.
Учебный элемент 1: «Ознакомление с помещением и оборудованием ветеринарной лаборатории. Техника безопасности. Документация»
Ветеринарная лаборатория предназначается для осуществления диагностических исследований, контроля за санитарным качеством кормов и качеством проводимой дезинфекции. Ветеринарная лаборатория осуществляет проведение профилактических, лечебных и ветеринарно-санитарных мероприятий.Ветеринарные лаборатории могут размещаться также на территории городов и иных населенных пунктов. В этом случае они обслуживают близлежащие хозяйства и поголовье животных, находящееся у населения.
В состав ветеринарной лаборатории входят:
- лабораторное отделение (лабораторный корпус);
- склад дезсредств.
В лабораторном отделении (корпусе) размещаются:
- комнаты специалистов;
- аптека;
- кладовая для биопрепаратов (с холодильником);
- бактериологическое отделение, в состав которого входят, как минимум, два стерильных бокса;
- химико-токсиологическое отделение;
- паразитологическое отделение;
- моечная - стерилизационная;
- комната для подготовки проб для исследований и проведения лечебно-профилактических мероприятий.
Лабораторный корпус, как правило, проектируется и строится вместе с виварием, в состав которого входят помещения для подопытных животных и птиц, помещения для кормов.
В состав склада дезсредств, который располагается недалеко от ветеринарной лаборатории, входят кладовые для дезсредств.
Учебный элемент 2: «Способы взятия патологического материала от животного.Методы консервирования, упаковки и транспортирования патологического материала для бактериологического исследования. Сопроводительная документация»
Патологический материал необходимо брать стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого берут патологический материал, на месте разреза следует обжечь над пламенем или прижечь нагретой металлической пластинкой.
Патологический материал должен быть взят как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года, т.к. сразу же после заболевания (или впервые же 1-2 дня) барьерная роль кишечника значительно ослабевает, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссиминации кишечной флоры.
Кроме того, по мере углубления инфекционного процесса количество вируса может снижаться в результате одновременного воздействия защитных сил организма.
Следует учитывать, что при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть вообще не обнаружен или его количество окажется очень незначительным.
Вторая причина необходимости экстренного взятия материала – избежать посмертных изменений в тканях, иначе они могут оказаться непригодными для бактериологических и вирусологических исследований.
Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни:
· от больных с выраженной клиникой с указанием температуры, частоты пульса и дыхания (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы);
· от убитых в агонии (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы);
· от выздоравливающих животных (кровь).
Взятые пробы следует как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов разложения материала. Такие условия обеспечивают низкие температуры.
Если патологический материал невозможно доставить в лабораторию в течение ближайших 24-30 часов, его посылают только в консервированном виде.
Патологический материал (органы или их части) консервируют 30-50%-ным раствором химически чистого глицерина на физиологическом растворе. Физиологический раствор предварительно стерилизуют при 1200С в течение 30 мин.
Материал можно консервировать также в стерильном вазелиновом масле. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве 4-5 раз, превышающем его объем. Консервированные образцы желательно хранить в холодильнике.
Небольшие трупы (поросят, мелких животных можно посылать целиком во влагонепроницаемой таре).
Трубчатые кости посылают на исследование в целом виде, очищенными от мышц и сухожилий. Кости завертывают в марлю или полотно, смоченные дезинфицирующей жидкостью и пересылают в сейф - пакетах или в стерильных полиэтиленовых пакетах.
Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от фекальных масс, а концы кишечника перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями.
Кишечник помещают в банки с 30%-ным водным раствором глицерина или насыщенным водным раствором поваренной соли. Объем консервирующей жидкости должен превышать объем взятого материала в 4-5 раз.
Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках, банках, которые закрывают пергаментной бумагой, пробками или в контейнерах.
Кал от трупов животных можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов, он должен быть доставлен в лабораторию не позднее 24 ч после его взятия.
Для исследования участков кожи берут наиболее пораженные ее кусочки размером 10x10 см и посылают в стерильной, герметически закупоренной посуде.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Из каждой доли вымени берут последние порции молока по 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
Пробы мочи берут катетером в стерильную посуду. При его отсутствии мочу получают при естественном мочеиспускании или, вызывая последнее, раздражением наружных половых органов.
Пробы слизи из половых органов животных берут стерильным марлевым тампонам при помощи специальных инструментов конструкции Павловского, Жавордова, Казеева, а также применяемых при искусственном осеменении коров шприца-катетера или полистироловой пипетки, соединенной со шприцем.
Для получения смывов слизистой оболочки носовой полости, половых органов, конъюнктивы и др. полость орошают стерильным физиологическим раствором или солевым раствором Хенкса (см. приложение) и собирают стекающий раствор в емкости.
Иногда для получения смывов в полость вводят стерильный ватный тампон, смоченный физиологическим или солевым сбалансированным раствором. Тампоном тщательно протирают слизистую, извлекают его и помещают во флаконы с аналогичным раствором.
Мазки из носа, полости рта, прямой кишки и т.д. берут при помощи стерильных ватных тампонов на довольно длинных стерильных деревянных палочках. После взятия мазка тампон помещают в пробирку, заполненную соответствующей жидкостью.
Наиболее часто для этого используют реактив Хенкса с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, нистатин) и белковым стабилизатором, например, с 0,5% желатина или 0,5-1% альбумина бычьей сыворотки.
Упаковка и пересылка патологического материала
Трупы мелких животных, части трупов животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным.
Посылаемый материал должен быть тщательно упакован, чтобы предупредить возможность рассеивания инфекции в пути.
Упаковка должна быть трехслойной:
1) емкость, содержащая пробу, должна быть водонепроницаемой, а в случае использования подвижных буферных растворов - герметичной;
2) внутренняя упаковка должна быть водонепроницаемой с достаточным количеством поглощающего материала на случай утечки для впитывания всей жидкости, содержащейся в пробе (вата, бумага);
3) наружная упаковка предназначена для защиты внутренней от физических повреждений и воды (герметичный термоконтейнер).
При перевозке наиболее надежным способом консервирования вируссодержащих проб является их замораживание. При транспортировке проб на дальние расстояния следует использовать сухой лед. В качестве емкости для материала и льда используют пластмассовые контейнеры, легкие по массе, с хорошей теплоизоляцией, небьющиеся и прочные.
Следует избегать колебаний температуры, особенно резких ее перепадов, а также повторных замораживаний и оттаиваний. Температура является определяющим фактором, влияющим на выживаемость вируса во время перевозки. Титр вируса снижается очень быстро, если температура среды, в которой его транспортируют, поднимается выше 200С; у большинства вирусов это снижение происходит настолько быстро, что превращает последующее выделение вируса в пустую трату времени.
Если замораживание невозможно, то следует использовать один из следующих консервирующих растворов
Кроме правильно выбранного материала, взятого в подходящие сроки и пересланного с соблюдением необходимых условий, лаборатория нуждается в определенной информации, касающейся больного и диагностических проб. Вместе с пробами направлять подробное описание динамики заболевания животного (время появления, быстрота охвата, процент заболеваемости, наличие летальных исходов или тяжелых осложнений, период переболевания, клиническая картина, протокол вскрытия, чем лечили, прививали).
На взятый материал составляют сопроводительный документ с указанием хозяйства, даты и времени взятия, количества.
Если при вскрытии посылки в лаборатории обнаруживается несоответствие сопроводительному документу или порча патологического материала, то обязательно составляют акт, копию которого отправляют ветеринарному врачу, направлявшему материал в лабораторию.
Учебный элемент 3: «Освоение микроскопических методов исследований»
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле мы делали мазок, высушивали, фиксировали его и после этого окрашивали. Исследуемый материал распределяется тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.
Методика приготовления препарата:
1) Приготовление мазка.
На предметном стекле с обратной стороны карандашом по стеклу обводят круг диаметром 2-3 см. Жидкий исследуемый материал берут петлей и распределяют в области круга, а микробную культуру с поверхности плотной питательной среды снимают бактериальной петлей и растирают на предметном стекле в капле заранее нанесенной воды. Из кусочков паренхиматозных органов делают мазки-отпечатки, для этого местом свежего среза прикасаются к предметному стеклу, делая несколько отпечатков. Обязательное условие – мазок должен быть очень тонким.
2) Высушивание мазка производится на воздухе, для ускорения процесса можно сушить в теплом потоке высоко над спиртовкой.
3) Фиксация мазка преследует две цели: прикрепить бактерии к предметному стеклу и убить их, так как убитые микробы лучше окрашиваются. Фиксируют физическим или химическим методом. Суть физического – в медленном проведении стекла с мазком через пламя горелки, это грубый метод фиксации, который может привести к деформации формы клеток. При химическом методе фиксации препарат на 15 минут погружают в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира), метод щадящий.
4) Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений. При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор – анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе.
Механизм и этапы окраски по Граму.
1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.
2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)
3. Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промыть водой
5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.
Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону.
1. На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин
2. Снять бумагу, провыть мазок водой
3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промыть водой
5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин
6. Промыть водой, высушить и микроскопировать
* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.
Учебный элемент 4: «Проведение лабораторного анализа патологического материала на наличие возбудителя инфекции»
Лабораторная диагностика сибирской язвы.
Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».
Материалом для исследования является ухо павшего животного, на которое с особыми мерами предосторожности накладывают две лигатуры, а место среза прижигают. Исследуемый материал помещают во влагонепроницаемую тару, пломбируют, указывают верх тары, оформляют сопроводительный документ и направляют в лабораторию.
Микроскопическое исследование: в лаборатории из крови уха делают мазок, окрашивают по Граму, капсулы по Ольту (или Михину), а также обрабатывают сибиреязвенными люминисцирующими сыворотками. В препаратах, окрашенных по Граму, видны крупные грамположительные палочки (6-10 мкм), соединенные в короткие цепочки. В препаратах, окрашенных по ольту или Михину, концы палочек, обращенных друг к другу, резко обрублены и слегка втянуты, свободные концы закругленные, клетки окружены общей капсулой, что является важным диагностическим признаком.
Для выделения чистой культуры возбудителя, который является факультативным анаэробом, исследуемый материал вносят в МПБ и МПА и выдерживают 24 часа в термостате при 37 °С. Выросшие культуры просматривают, изучают культуральные свойства. Типичные для B. Anthracis крупные, серо-белые колонии R-формы, края которых под малым увеличением имеют вид завитков, получивших название «львиная грива». В препаратах, приготовленных из агаровой бактериальной культуры, бактерии располагаются в виде длинных цепочек. МПБ остается прозрачный, на дне проявляется хлопьевидный осадок. По мере старения бактерий, при накоплении продуктов метаболизма в культуральной жидкости, возбудитель сибирсокой язвы образует споры (бациллы), располагающиеся в центре палочки. Они не образуются при температуре ниже 12 °С и выше 42 °С, а также в живом организме и невскрытом трупе.
Для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы из исследуемого материала, загрязненного посторонней микрофлорой, делают посев в селективные среды, в состав которых вводят 200-500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост E. Coli, B. Subtilis, B. Cereus и др.
Для дифференциации выделенной культуры от сапрофитов ставят тест «Жемчужное ожерелье». Для чего готовят ряд последовательных разведений пенициллина и три колбочки с 20 мл расплавленного и охлажденного до 50 °С МПА. В первую колбу вносят 10 ЕД пенициллина, получают агар, содержащий 0,5 ЕД/мл; во вторую колбу вносят 1 ЕД пенициллина и получают агар с 0,05 ЕД/мл пенициллина; третью колбочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трёх колбочек разливают в стерильные пробирки по 5 мл в каждую с скашивают. Во все пробирки вносят по 0,25 мл 3-часовой исследуемой бульонной культуры. Посевы помещают в термостат при 37 °С в наклонном положении, так что бы бульонная культура распределилась по всей поверхности косого агара. Через три часа из конденсационной жидкости пробирок берут каплю материала, делают мазок, высушивают на воздухе, фиксируют химическим методом и окрашивают простым методом или по Граму. Под воздействием пенициллина только палочки сибирской язвы изменяются и приобретают шаровидную форму, появляется сходство с ожерельем из бус, поэтому при микроскопии такой культуры будут видны цепочки из шарообразных форм – феномен «Жемчужного ожерелья».
Гемолитическую способность изучают посевом выделенной культуры на кровяной МПА в чашках Петри. Возбудитель сибирской язвы, в отличие от сапрофитов, не обладает гемолитическими свойствами.
Если на исследование поступил загнивший материал, из него нельзя выделить чистую культуру и поэтому в нем определяют наличие специфических антигенов при помощи реакции кольцепреципитации. Для этого материал кипятят в физиологическом растворе (1:10) 30-40 минут. Полученный экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют по обычной методике в РП.
Для постановки биопробы на животных часть исследуемого материала растирают в ступке с небольшим количеством физиологического раствора. Двум белым мышам вводят 0,2-0,5 мл гомогената под кожу в области спины. Наблюдение ведут в течение 10 дней, в случае гибели мышей их вскрывают: из крови сердца, печени, селезенки и места заражения готовят мазки, а из органов делают посевы для выделения чистой культуры.
Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву является: наличие в мазках из патологического материала капсулообразующих бактерий, а в препаратах из колоний – грамположительных, неподвижных бацилл; на питательных средах – характерный рост; чувствительность к пенициллину и батериофагу, положительный тест РП и положительный результат биологической пробы.
6. Вирусология и биотехнология.
Учебный элемент 1: «Проведение вирусологического анализа патологического материала».
В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают, взвешивают и измеряют. Часть материала берут для вирусологических исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований.
Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Добавлять толченое стекло менее желательно, так как оно обладает щелочными свойствами и может инактивировать часть вирусных частиц. Но и на тонко растертых песчинках или частицах стекла, обладающих большой поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти затем в удаляемый осадок. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры (это делают редко, так как теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обрабатывая антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т. д.). Следует избегать излишне больших доз антибиотиков, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указываются в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней.
Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30—60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус 20 — минус 70 °С.
Подготовка выделений из носа, глаз. Тампоны, погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10—15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2—3 тыс. оборотах/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500—1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.
Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора. После гемогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2—3 тыс. мин-1 в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500—1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и 200 мкг тетрациклина на 1 мл. После 30—60-минутного контакта производят посев па стерильность, замораживают и хранят при минус 10 — минус 20 °С. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося после замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследования.
Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше, чем при исследовании кала.
Мочу обрабатывают антибиотиками (500—1000 ЕД/мл) и используют для заражения.
Содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки исследуют при кожных высыпаниях. Содержимое папул и пузырьков разводят физиологическим раствором 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5—1:10 и центрифугируют при
3 —3 тыс. мин-1 в течение 10—15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200—500 ЕД/мл) материал используют для заражения.
Подготовка крови. Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лаковая» кровь, либо кровь с антикоагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5—6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2 —3 тыс. мин-1 в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100—200 ЕД/мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2).
Отбор крови для серологических исследований. Для серологической диагностики необходимо иметь сыворотки двух проб крови (парные сыворотки), взятых в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше – в инкубационный период или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую – во время выздоровления или через 2-3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо стерильно, нельзя применять антикоагулянты или консерванты, которые могут сделать сыворотку антикомплементарной, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус или оказаться токсичными для культур клеток либо просто нестерильными. Кровь в объеме 10-15 мл берут в стерильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой и переносят в холодильник при 4°С на 18-20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку отсасывают, добавляют антибиотики – пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифуговать.
Учебный элемент 2: «Проведение серологического анализа».
Этот раздел я рассмотрю на примере серологических реакций при бешенстве.
При постановке реакций на бешенство используются РИФ, РДП.
РИФ: используются антирабический гамма-глобулин. На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головнного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарии, мозжечок и продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратом каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, под челюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 15 — минус 20 °С) от 4 до 12 ч, высушивают на воздухе, наносят флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывами физиологическим раствором или фосфатным буфером с pH 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдаются разной величины и формы флуорес цирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще ши клеток. В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.
Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.
В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.
РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при втрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген + антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).
Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5—3 мл расплавленного 1,5%-ного раствора агара. После застывания в агаре делают лунки диаметром 4-5 мм по трафарету, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами по схеме:
От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и правой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) — какие-либо три отдела мозга, у мышей — весь мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.
Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету. После заполнения лунок компонентами препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37 °С на 6 ч, затем при комнатной температуре — на 18 ч. Учет результатов ведут в течение 48 ч.
Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин.
Бактериальная нестерильность и загнивание мозга не препятствуют использованию его для РДП. Материал, консервированным глицерином, формалином и другими средствами, для РДП непригоден.
Учебный элемент 3: «Кормление и уход за лабораторными животными. Биопроба».
В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных этих видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.
Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых или даже новорожденных животных. Также лабораторные животные должны быть здоровы.
Заражают животных различными методами: подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, интраназальное, интрацеребральное.
Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой — исключено взаимное перезаражение и распространение инфекци
