Совместная работа студента с преподавателем

Лабораторная работа № 6

Изучение микроморфологических особенностей продуцентов биологически активных веществ (на примере продуцента омомицина Streptomyces chromopurpureos) на разных стадиях культивирования (трофофаза, идиофаза) с выбором оптимальных условий процесса биосинтеза антибиотика

Занятие № 13

Тема занятия: Изучение микроморфологических особенностей продуцентов биологически активных веществ (на примере продуцента омомицина Streptomyces chromopurpureos) на разных стадиях культивирования (трофофаза, идиофаза) с выбором оптимальных условий процесса биосинтеза антибиотика

Цель работы: научиться определять стадии роста и биосинтеза продуцента, т.е. определять трофофазу и идиофазу методом микроскопирования окрашенного мазка культуральной жидкости.

Задачи обучения:

· Научиться идентифицировать микроморфологические признаки продуцента в стадии роста (трофофаза) после окраски метиленовой синью;

· Научиться идентифицировать признаки продуцента в стадии биосинтеза (идиофаза);

· Уметь сравнить микроскопию двух фаз – интенсивность окраски, вид и размер клетки, наличие внутриклеточных включений, дифференциацию протоплазмы, образование спор;

· Уметь измерять объемную биомассу на разных стадиях культивирования продуцента и построить кривую роста.

Материальное обеспечение работы ( Материалы и приборы)

· культуральная жидкость продуцента омомицина;

· метиленовая синь;

· предметные стекла;

· пипетки стеклянные;

· фильтровальная бумага;

· пробирки мерные.

· микроскоп;

· осветитель к микроскопу;

· центрифуга;

· газовая горелка.

Задание № 1. Исследовать динамику кривой роста продуцента с определением стадий процесса биосинтеза и сравнительной характеристикой цитохимических признаков продуцента в трофофазе и идиофазе.

Методика выполнения работы (порядок выполнения работы)

· Отбирают пробы культуральной жидкости из колбы при ее одновременном перемешивании, что позволяет отобрать среднюю пробу.

· Переносят отобранную культуральную жидкость в мерную пробирку до отметки 10 мл.

· Уравновешивают пробирки с отобранными пробами на весах.

· Центрифугирируют пробирки с отобранными пробами культуральной жидкости при 2000 об/мин в течение 10 мин. Пробирки извлекают из центрифуги только после окончательной остановки ротора.

· Определяют процентное содержание биомассы относительно всего содержимого пробирки (в начальной стадии возможно неполное исчерпание питательной среды и как результат присутствие в осадке нерастворимых компонентов среды вместе с биомассой).Отличить биомассу от компонентов среды помогает преподаватель.

· На основе полученных данных строят график; по оси абсцисс указывается время взятия пробы, по оси ординат – количество образовавшейся биомассы.

· Из колб с культуральной жидкостью с пометкой «48 ч роста» и «168 ч» роста отбирают пипеткой пробы, переносят на предметные стекла и растирают по их поверхности.

· Пробу культуральной жидкости на стекле сушат на воздухе или в пламени горелки так, чтобы стекло не перегревалось. Перегрев культуральной жидкости приведет к деформации клеток продуцента и нарушит цитологическую картину при микроскопировании.

· Высохшую пробу культуральной жидкости на стекле фиксируют в пламени горелки, направляя стекло в пламя со стороны нанесенной пробы. Проводят трижды стекло через пламя медленными движениями, после чего стекло остужают при комнатной температуре.

· Остуженное предметное стекло с нанесенной пробой помещают на специальную полочку над кристаллизатором и окрашивают метиленовой синью, нанося краситель на всю поверхность мазка и выдержав 30-60 с. По окончании окраски излишек красителя сливают на фильтровальную бумагу и промывают стекло под тонкой струей воды, при этом проба на стекле должна быть расположена с обратной стороны от струи воды и омываться лишь стекающими каплями. Промывку осуществляют до обесцвечивания стекающей воды, после чего излишки воды промокают фильтровальной бумагой, устанавливая стекло ребром. Сушат стекла на воздухе или в пламени горелки, не допуская перегревания.

· Проводят микроскопию окрашенного мазка.

· Полученные данные фиксируют в рабочем журнале; микроскопию зарисовывают и описывают; на графике роста культуры в процессе ферментации обозначают стадии культивирования. По данным микроскопии указывают трофофазу и идиофазу.

 

Совместная работа студента с преподавателем

Самостоятельная работа студентами выполняется под непосредственным контролем преподавателя. После выполнения задания студенты должны представить тетради на проверку преподавателю и отдать лаборанту для обработки использованную лабораторную посуду.

Контрольные вопросы:

1. По каким микроморфологическим принзнакам идентифицируются продуценты в стадии роста (в тропофазе)?

2. По каким микроморфологическим принзнакам идентифицируются продуценты в стадии биосинтеза (в идиофазе)?

3. По каким признакам сравнивают микроскопию двух фаз?

4. Как можно измерять объемную биомассу на разных стадиях культивирования продуцента и построить кривую роста?

 

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:

1. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Изд. центр «Академия», - 2008. – 208 с.

2. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций. – Минск.: БГУ, 2002. - 105 с.

3. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология: Учебное пособие. – М.: Изд. Центр «Академия». – 2006. – 256 с.

4. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология. Руководство к практическим занятиям. – Учебное пособие. – Под ред. акад. РАМН В.А. Быкова, проф. А.В Катлинского. – М.: ГЭОТАР-Медиа 2009. – 384 с.

5. Елинов Н.П. Химическая микробиология. - Учебник. - М.: Высшая школа. - 1989, 448 с

1. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. - Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ. - 1989, 294 с.
2. Биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. - М.: Мир. - 1988, 480 с.
3. Чуешов В.И., Зайцев А.И., Шебанова С.Г. Промышленная технология лекарств. Том 2. Харьков, 2002.
4. Биотехнология микробного синтеза (Под ред. Бекера М.Е.) – Рига – 1980.
5. Биотехнология. /Отв. редактор А.А. Баев. - М.: Наука. - 1984, 310 с.
6. Никитин Г.А. – Биохимические основы микробиологических производств – Киев, 1981.
7. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов. М., - 1979 г.
8. Попова Т.В. – Развитие биотехнологии в СССР – М., Наука - 1988 г.
9. Промышленная микробиология (Под ред. Егорова Н.С.) – М., 1989 г.
10. Популяционные аспекты биотехнологии – Печуркин Н.С., Брильков А.В., Маркенкова Т.В. – Новосибирск: - Наука – 1990 г.
11. Процессы и аппараты химической технологии (Под ред. П.Г. Романкова). – Л. – 1981.
12. Специальные журналы: «Биотехнология», «Фармация Казахстана», «Фармация», «Фармацевтический бюллетень», и др.

 

 

Лабораторная работа № 8.

«Определение оптимальных параметров ведения процесса биосинтеза противоопухолевого антибиотика рубомицина»

Занятие № 14

Тема занятия: Определение оптимальных параметров ведения процесса биосинтеза противоопухолевого антибиотика рубомицина

Цель: научиться анализировать параметры процесса биосинтеза БАВ и определять оптимальные параметры для биосинтеза антибиотиков и других БАВ.

Задачи обучения:

· изучить представленные в виде таблицы параметры двух процессов синтеза рубомицина и представить данные в виде графика;

· охарактеризовать эти процессы и выбрать из них оптимальный (время начала биосинтеза, какими изменениями сопровождается процесс биосинтеза рубомицина^♠).

При описании процесса руководствоваться предложенной в примечании схемой изложения и дополнить собственными выводами.

Ферментация № 1 (аппарат «Chemap 1»)

· Состав среды, %:

· крахмал картофельный – 6,5;

· соевая мука – 1,7;

· глюкоза – 1,5;

· (NH₄)₂SO₄ – 0,4;

· K₂HPO₄ – 0,01;

· CaCO₃ - 0,5;

· pH (перед посевом) 7,1.

 

Таблица 5. Показатели ведения процесса в аппарате «Chemap 1» с использованием крахмальной среды

№ пробы	Часы роста	Биомасса, %	рН	Углеводы общие	Глюкоза	Азот	рО2, %	Активность, мкг/мл
		-	7,1	6,55	1,56	86,8
			6,9	6,22	1,56	86,8
			6,9	5,98	-	84,0
			6,5	5,36	-	81,2		306,6
			7,0	4,31	-	53,2		297,3
			8,2	4,31	-	89,6

Ферментация №2 (аппарат «Сhemap 2»)

Состав среды, %:

• Гороховая мука – 3;
• Сахароза – 7;
• NaCl – 0,4;
• KCL – 0,04;
• K₂ HPO₂ – 0,08;
• (NH₄)₂SO₄ – 0,4;
• СаСО₃ – 0,8;
• рН (перед посевом) 7,41.

Таблица 6. Показатели ведения процесса в аппарате «Сhemap 2» с использованием сахарозно-гороховой муки

 

№ пробы	часы роста	биомасса, %	рН	углеводы общие	глюкоза	азот	рО2,%	активность, мкг/мл
		-	7,15	5,57	0,88	114,8		50,7
			7,07	5,54	-			160,6
			6,7	4,0	-	81,2		335,8
			6,75	3,41	-			552,8
			6,75	2,32	-	8,4		685,8
			6,6	0,9	-	1,02

Порядок выполнения работы

• Используя приведенные данные, построить кривые изменения для каждого параметра; по оси ординат начертить индивидуальную шкалу.
• Для каждого процесса ферментации построить отдельный график.
• Зависимость накопления антибиотика от изменения параметров описывают для каждого процесса после выполнения графического рисунка.
• Для двух процессов сделать обобщающий вывод оптимальных изменений, ведущих к выходу максимального количества антибиотика.

Примечание: а) При характеристике процессов использовать:

• Продолжительность лог-фазы ….ч, в этот период (не) наблюдается ….;
• Прирост биомассы максимальный на … ч роста, фаза роста (трофофаза продолжается до … ч от начала процесса и характеризуется значением рН - …, азота - …, углеводов - …, интенсивность дыхания - …);
• Начало синтеза антибиотика совпадает со снижением …;
• Биомасса на … ч, торможение прироста биомассы совпадает с …;
• Максимальная скорость биосинтеза совпадает с …

 

б) При выборе оптимального процесса обратить внимание на:

• Исчерпание компонентов среды с учетом скорости потребления;
• Зависимость биомассы от активности (удельная активность) продуцента;
• Влияние параметров на окончание процесса;
• Возможность продления процесса для увеличения выхода антибиотика при применении подпитки (каким компонентом среды и предположительно какую концентрацию следует поддерживать на протяжении процесса с учетом представленных данных).