1. Метод бумажных дисков на питательном агаре. В чашку Петри на питательный агар делают посев микробной взвеси. Избыток жидкости удаляют пипеткой. После впитывания взвеси в агар на засеянную поверхность пинцетом наносят 5-6 разных бумажных дисков с антибиотиками, диски отличаются по цвету. Чашки с дисками ставят в термостат при 37°С на 18-20 часов. Антибиотики из дисков диффундируют в агар. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры судят о ее чувствительности к антибиотикам. Этот метод нельзя применять, если антибиотики плохо диффундируют в агар. Преимущество метода – можно определить чувствительность исследуемой бактериальной культуры сразу к нескольким антибиотикам.
2. Метод серийных разведений в МПБ. Готовят основной раствор антибиотика в соответствующем растворителе. Из основного раствора готовят последующие 2-хкратные разведения в бульоне. Обычно берут 12 пробирок по 1 мл МПБ в пробирке. После последовательных разведений антибиотика в МПБ, в каждую пробирку добавляют 0,1 мл взвеси клеток испытуемой бактериальной культуры, содержащей 106-107 клеток. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч. Результаты отмечают по наличию роста. Если есть рост бактерий – среда мутная. Если нет роста бактерий – среда прозрачная. Если среда в пробирке мутная, то в данной концентрации антибиотик не действует, если прозрачная– антибиотик действует. По последней пробирке с прозрачной средой определяют минимальную ингибирующую дозу антибиотика. Одновременно ставят контрольные пробы: 1-ый контроль (контроль бактериальной культуры) - 1 мл МПБ + взвесь бактерий без антибиотика, 2-ой контроль (контроль антибиотика) - 1 мл МПБ + антибиотик, но без взвеси бактерий. В контрольных пробирках должны быть следующие результаты: 1-ый контроль – помутнение среды (есть рост); 2-ой контроль – среда прозрачная (нет роста). Для того, чтобы узнать какое действие оказал антибиотик (бактерицидное или бактериостатическое), петлей делают посевы из пробирок на сектора ПА. Роста нет – бактерицидное действие, рост есть – бактериостатическое действие. Преимущество метода – определение минимальной концентрации антибиотика, которая ингибирует (подавляет) рост бактериальной культуры.
3. Метод «канавки» (предложен А. Флемингом). Берут чашку Петри с питательным агаром. В центре по диаметру вырезают полоску агара шириной 1 см. Затем канавку заполняют агаром, смешанным с антибиотиком. После застывания канавки перпендикулярно делают посев исследуемых культур (4-5). После инкубации в термостате чувствительность определяют по длине зоны задержки роста, чем она больше, тем культура чувствительнее и наоборот. Преимущество метода – можно определить чувствительность сразу нескольких культур к данному антибиотику.
Биологическая активность антибиотика – это его способность убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов. Активность выражают в единицах действия (ЕД). 1 ЕД - минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма тест-микроба в определенных условиях. Так, для пенициллина 1 ЕД является минимальное количество, способное задержать рост золотистого стафилококка штамма 209-р в 50 мл МПБ. Для стрептомицина 1 ЕД должна задерживать рост E.coli в 1 мл МПБ.
В настоящее время активность большинства антибиотиков измеряется в мкг. Обычно 1мкг химически чистого препарата соответствует 1 ЕД. Для бензилпенициллина 1мг содержит 1670 ЕД, в 1 мг нистатина содержится 4000 ЕД.
Методы определения активности антибиотиков.
1) методом серийных разведений;
2) методом диффузии в агар.
Для определения активности антибиотиков в качестве тест - культуры используют непатогенные или условно-патогенные микробы, проявляющие наибольшую чувствительность к данному веществу. Так, для определения активности пенициллина используют S. аureus 209-р.
1. Определение активности антибиотиков методом серийных разведений. Берут ряд пробирок с одинаковым объемом МПБ (1-10 мл). Количество пробирок определяется количеством разведений (степенью разведения) антибиотика. В первую пробирку вносят определенное количество антибиотика, перемешивают, определенный объем раствора переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают, из второй пробирки – в третью и т.д. Из последней пробирки такой же объем выливают, чтобы во всех пробирках содержался одинаковых объем жидкости. Контроль – пробирка без антибиотика. Во все пробирки с разведениями антибиотика и контрольную пробирку вносят 0,1 мл взвеси тест культуры (2,5 ×106 клеток в 1 мл). На следующий день определяют разведение антибиотика, при котором в пробирке нет роста - среда осталась прозрачной (если нет роста, следовательно антибиотик подействовал). Эта наименьшая концентрация и есть минимальная активная доза антибиотика.
Можно использовать этот метод с применением плотной среды, в том случае, если микробы не растут на жидких средах (для туберкулезных палочек – свернутую сыворотку). Разведения антибиотика в среде готовят следующим образом. Вначале готовят различные разведения антибиотика в растворителе, а затем по 1 мл каждого разведения вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45-50°С МПА. Пробирки скашивают для застывания агара, а на поверхность среды петлей засевают тест-культуру.
2. Определение активности антибиотика методом диффузии в агар.
Питательный агар (ПА) по 15 мл разливают в чашки Петри. После застывания и подсушивания агара в каждую чашку наливают по 5 мл ПА, смешанного с тест культурой (20 млн. клеток на 1 мл среды). После застывания второго слоя агара на его поверхность наносят по трафарету 6 цилиндров и делают 6 лунок. В 3 лунки вносят по 0,1 мл испытуемого раствора антибиотика, в другие 3 лунки – по 0,1 мл стандартного раствора. Через 16-18 часов термостатирования при 37°С цилиндры удаляют и измеряют диаметр зон задержки роста. Активность антибиотика устанавливается с помощью расчетной таблицы ГФК или по стандартной кривой на основе диаметра задержки роста.
