Вопрос 54. Возбудитель менингококковой инфекции

/. Морфология менингококка

2. Биология и кулыпуральные свойства менингококка

3. Антигенное строение, серотипы

1. Возбудитель эпидемического менингита человека — менингококк (Neisseria meningitidis) впервые был открыт в 1887 г. Менингококки могут быть обнаружены в носоглотке человека и вызывают у последнего в ряде случаев ринофарингит. Особого внимания в патологии человека заслуживают как возбудители воспаления мозговых оболочек (цереброспинальный менингит) и иногда сепсиса.

Морфология менингококка. Менингококки представляют собой грамотрицательные сферические клетки диаметром 0,6— 0,8 мкм. Расположенные попарно. Парное расположение выражено особенно ясно при рассмотрении мозгов, изготовленных из спинномозговой жидкости. В спинномозговой жидкости менингококки часто располагаются внутриклеточно и имеют форму кофейного зерна. В ряде случаев можно наблюдать их в значительном количестве внеклеточно. В мазках из культур менингококки располагаются попарно, иногда в виде тетрад. Характерной особенностью менингококков является их полиморфизм. В мазках из свежих культур они имеют вид небольших сферических клеток, в старых (3—5 суток) культурах наряду с небольшими сферическими клетками могут наблюдаться в значительном количестве гигантские клетки этих микробов. Менингококки неподвижны, жгутиков не имеют, спор не образуют.

При изучении культур под электронным микроскопом обнаружена трехслойная клеточная стенка, образованная белками, липидами и липополисахаридами, снаружи имеется слой полисахарида, который формирует капсулу.

2. Менингококки — аэробы, биохимически малоактивны, разлагают только глюкозу и мальтозу. Оптимальная температура, при которой наблюдается хороший рост, лежит в пределах 35— 37 "С. Менингококки исключительно требовательны к составу питательных сред, размножаются только в присутствии человеческого или животного белка или специального набора аминокислот.

Хорошо растут на таких питательных средах, как среда Леффлера и различные яичные среды. При посеве на плотные питательные среды (сывороточный агар) через 18—24 ч образуются колонии менингококка. Они бесцветны, нежны, имеют диаметр от 0,5 до 1,5 мм, по внешнему виду напоминают колонии шигелл Флекснера. На средах с добавлением крови колонии непрозрачны, беловато-серые и достигают больших размеров. В бульоне рост появляется в виде равномерной мути с нежной пленкой на поверхности.

Устойчивость к физическим и химическим факторам. Устойчивость менингококка к различным физическим и химическим факторам весьма низкая. Менингококки гибнут в течение 5 мин и даже быстрее при температуре 55 °С. К низкой температуре они устойчивы. 1%-ный раствор фенола или 0,1%-ный раствор сулемы убивают менингококков в течение 1—2 мин, очень чувствительны они ко всем дезинфектантам. Прямой солнечный свет убивает менингококки за 2—8 ч, под действием ультрафиолетовых лучей возбудитель погибает практически мгновенно.

3. Возбудители экзотоксина не образуют, но при гибели микробной клетки высвобождается эндотоксин липополисахаридной природы. По антигенной структуре менингококки подразделяются на ряд серологических групп: А, В, С, D, X, Y, Z и др. Серологические группы менингококков отличаются друг от друга особенностями антигенной структуры. Менингококки имеют следующие виды антигенов:

• представленные белками и полисахаридами;

• видовой антиген белковой природы;

• группоспецифические, представленные гликопротеидным комплексом;

• типоспецифические, белковой природы, позволяющие разграничивать различные серотипы, в основном серологических групп В и С. Менингококковые антигены не являются строго специфичными. Это затрудняет оценку результатов серологического обследования людей при изучении иммунологического к менингококковой инфекции.

Под влиянием сульфаниламидов и антибиотиков проявляется изменчивость менингококков. Изменчивость касается морфологических, гистохимических и антигенных свойств микробов. Особенно лабильными являются антигенные свойства: образование неагглютинирующихся типовыми сыворотками вариантов и штаммов, агглютинирующихся несколькими типовыми сыворотками. Установлена способность менингококка к образованию таких измененных вариантов, как L-формы, формы гете-роморфного роста.

L-формы могут быть стабильными и нестабильными, они обладают значительной резистентностью к пенициллину. L-формы являются одним из причинных факторов затяжного течения менингококковых менингитов.

Вопрос 55. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции

1. Забор материала

2. Бактериоскопический и бактериологический методы исследования

1. Для исследования берут:

• слизь из носоглотки;

• спинномозговую жидкость;

• розеолы при менингококковом сепсисе;

• кровь;

• у умерших исследуют гной из спинномозговых оболочек и материал из воспалительных органов.

Спинномозговая жидкость берется при люмбальной пункции в 3 пробирки. Спинномозговая жидкость исследуется в лаборатории с помощью:

• общего анализа (реакция Панди, количество белка и цитоз);

• биохимического анализа (определение сахара и хлоридов);

• бактериологического анализа.

Пробирка со спинномозговой жидкостью может сохраняться в течение нескольких часов в термостате при температуре 37 °С.

Макроскопически жидкость при менингококковом менингите может быть слегка мутноватой, мутной, гнойной, густой с желтоватым или зеленоватым оттенком. В клеточном составе преобладают нейтрофилы, общее количество белка повышенно —от 0,66 до 3—8% и более. Содержание сахара и хлоридов несколько снижается.

2. Наиболее ранним простым методом исследования является бактериоскопия мазка спинномозговой жидкости. Для этого из осадка приготовляется мазок, фиксируется, окрашивается ме-тиленовой синькой или по Граму. Обнаружение внутри- и вне-клеточно расположенных грамотрицательных диплококков, имеющих типичную морфологию, является важным диагностическим признаком. Бактериоскопическим анализом диагноз подтверждается в 50—70% случаев. Выделение чистой культуры менингококка из ликвора более достоверно, но занимает 3—4 дня. Предварительный ответ может быть получен через сутки.

Бактериологический метод по частоте обнаружения возбудителя уступает бактериоскопическому. При одновременном использовании обоих методов частота подтверждения диагноза достигает 70%. Отрицательные результаты бактериологического исследования не исключают менингококковой природы заболевания.

П.П. Чибирас предложена бактериоскопия мазков крови или толстой капли крови в целях обнаружения менингококка. Метод прост и высокорезультативен, является экспресс-методом. Мазки крови окрашиваются после фиксации по Романовскому-Гимзе, а препараты толстой капли - без фиксации 1%-ным водным раствором метиленовой синьки в течение 2 мин. В мазках крови почти в каждом поле зрения удается обнаружить 5—20 менингококков, фагоцитированных нейтрофилъными лейкоцитами. Аналогичным методом предлагается исследовать спинномозговую жидкость.

Серологические методы диагностики последнее время не нашли широкого применения в силу малой результативности. Из иммулогических методов наиболее чувствительны и информативны реакция непрямой гемагглютинации и иммунофер-ментный метод.

Вопрос 56. Возбудитель стрептококковой инфекции

/. Стрептококковые инфекции

2. Морфология, биология стрептококка

3. Антигенное строение; классификация

4. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций

1. Стрептококки (Streptococcus) — возбудители большого числа инфекций человека и животных, они вызывают рожистое воспаление, сепсис и гнойные инфекции, скарлатину, ангину. Имеются непатогенные разновидности, обитающие в полости рта и кишечника человека. Анаэробные штаммы стрептококков обладают незначительной степенью активности, и их обнаруживают обычно в полости рта и пищеварительном тракте человека. В некоторых случаях они вызьшают хронические воспалительные процессы и являются возбудителями раневых инфекций. Значительно большее значение в патогенезе стрептококковых инфекций человека имеют факультативные анаэробы, которые разделены по характеру гемолиза на агаре с кровью на следующие типы:

• бета-гемолитические стрептококки;

• альфа-гемолитические стрептококки;

• гамма-гемолитические стрептококки, не вызывающие видимого гемолиза на твердых питательных средах с кровью.

Наибольшей патогенностью обладают бета-гемолитические стрептококки, которые являются возбудителями большинства стрептококковых инфекций у человека. Патогенность альфа-гемолитических стрептококков менее выражена. Обнаруживаются они в слизи зева здоровых людей, но в некоторых случаях и при хрониосепсисе, подостром септическом эндокардите, инфекциях полости рта. Гамма-гемолитические стрептококки — сапрофиты верхних дыхательных путей и кишечного тракта человека. В некоторых случаях они вызывают подострый септический эндокардит, инфекции мочевых путей, раневые инфекции.

2. Морфология стрептококков: это неподвижные шаровидные или овальные кокки диаметром 0,8—1 мкм, образующие цепочки различной длины и положительно окрашивающиеся по Граму. Часть штаммов образуют капсулу. Длина цепочек связана с условиями выращивания. В жидкой питательной среде они длиннее, на плотных средах нередко расположены в виде

коротких цепей и пучков. Кокки перед делением могут быть овоидными. Деление происходит перпендикулярно по отношению к цепи. Каждый кокк делится на 2.

Биология стрептококков, культуральные свойства: на агаре с кровью стрептококк образует мелкие (1—2 мм в диаметре) полупрозрачные палочки, сероватые или бесцветные, которые хорошо снимаются петлей. Величина зоны гемолиза варьирует у разных штаммов: группа А образует зону гемолиза, несколько превышающую диаметр колонии, группа В дает большую зону гемолиза. Стрептококки типа А образуют зеленоватую или зеленовато-коричневую зону гемолиза, мутноватую Или прозрачную, варьирующую по величине и интенсивности окраски. В некоторых случая сама колония приобретает зеленоватое окрашивание. В жидких питательных средах для стрептококков характерен придонный, часто поднимающийся по стенкам рост. При взбалтывании зернистая или хлопьевидная взвесь. Общепринятые среды для выращивания: мясо-пептонный агар с добавлением крови кролика или барана, полужидкий агар с сывороткой.

Хороший рост и токсинообразование могут быть обеспечены на "комбинированном бульоне" или на средах, содержащих казеиновый гидролизат и дрожжевой экстракт. Гемолитические стрептококки метаболизируют глюкозу с образованием молочной и других кислот, что является фактором, лимитирующим рост микробов в питательной среде. Устойчивость к физическим и химическим факторам.

Гемолитические стрептококки группы А в течение длительного времени могут сохраняться на предметах, в пыли в высушенном состоянии. Однако эти культуры, сохраняя жизнеспособность, утрачивают вирулентность.

Стрептококк группы А высокочувствителен к пенициллину, который оказывает на него бактерицидное действие. Сульфаниламид действует на стрептококк А бактериостатически.

3. Современная классификация стрептококков основана на их серологических различиях. Известно 17 серологических групп: А, В,

С, D, E, F и т. д. Деление на группы основано на наличии у представителей разных групп специфического полисахарида (субстанция С). Патогенны для человека стрептококки группы А. Стрептококки разных групп отличаются не только поспособности вызывать заболевания у человека и животных и по своему природному обитанию, но и по биохимическим и культуральным особенностям.

Кроме серологических различий, при дифференииаиии штаммов учитывают следующие показания:

• источник выделения;

• характер гемолиза;

• способность к образованию растворимого гемолиза;

• резистентность к различным температурам;

• особенность расти в молоке с метиленовым синим;

• ферментацию Сахаров;

• разжижение желатина.

Серологические серотипы: методом агглютинации на стекле штаммы бета-гемолитического стрептококка, выделенного при скарлатине и других стрептококковых инфекциях и от здоровых носителей, были разделены на 50 серологических типов. Культуры 46 типов отнесены к группе А, типы 7, 20, 21 — к группе С и тип 16 — группе Г.

Деление стрептококков на типы производится и с помощью реакции преципитации. Результаты определения типа по реакции агглютинации и в реакции преципитации обычно дают совпадающие результаты. При скарлатине обычно преобладает

1 или 2—3 типа. Обнаружены общие антигенные субстанции в штаммах, принадлежащих к группам А, С, Q.

В стрептококковом (при скарлатине) токсине содержатся

2 фракции:

• термолабильная или истинный скарлатинозный токсин;

• термостатическая, которая обладает свойствами аллергена.

Истинный эритрогенный токсин является протеином. Это экзотоксин стрептококка, который вызывает реакцию Дика у восприимчивых к скарлатине людей. Очищенный эриторген-ный токсин применяют для кожных проб с целью определения уровня антитоксического иммунитета (реакция Дика).

4. Для бактериологического исследования материал, собранный тампоном со слизистой зева и носа, засевают на чашку Петри с кровяным агаром, ставят в термостат на 3—4 ч при 37 °С. При наличии стрептококков через сутки на агаре вырастают характерные палочки. Для микроскопического исследования изолированную колонию пересевают в жидкую питательную среду (мясо-пептонный бульон с сывороткой) и через 24 ч выращивания в термостате подвергают исследованию. Мазки окрашивают по Граму или метиленовым синим по Леффлеру. Затем изучают биохимические свойства культур и определяют тип стрептококка с помощью реакции агглютинации на стекле и реакции преципитации с типовыми сыворотками. Из серологических реакций применяют реакцию связывания комплемента (РСК) с сывороткой иммунизированного кролика.

Вопрос 57. Капсульные бактерии

/. Группа капсульных бактерий

2. Морфология, биология и антигенные свойства капсульных бактерий

3. Лабораторная диагностика

1.Капсульные бактерии. К ним относятся клебсиелды — группа грамотрицателъных неспорообразующих и неподвижных палочек, которые обладают обычными капсулами и на питательных средах образуют слизь.

Основными видами этого рода являются палочка склеромы (ри-носклеромы), палочка озены и дигаюбациллы Фридлендера, вызывающие пневмонию. Капсульные бактерии обнаруживаются в слизи носа и зева больных склеромой и озеной, в мокроте и в тканях легких больных фридлендеровской пневмонией, при инфекциях мочевых путей и в испражнениях человека, а также в объектах внешней среды.

2. Морфология: короткие с закругленными концами палочки, 2— 3 мкм в длину и 0,5—1 мкм в ширину, располагаются одиночно или часто попарно. Они не имеют жгутиков и не образуют спор. Слизистая форма микроба окружена широкой овальной или круглой капсулой. Ввиду того что капсула слабо окрашивается анилиновыми красками, для окрашивания самой капсулы препарат обрабатывают этиловым или метиловым спиртом, смешанным с уксусной кислотой и солями некоторых тяжелых металлов.

Биология капсульных бактерий, культуральные свойства: клебсиеллы хорошо растут и размножаются на простых питательных средах. В качества источника азота и углерода, необходимых для построения белка, они используют аммонийные соли, глюкозу или молочную кислоту.

При определении ферментативной способности ограничиваются всего лишь 3 углеводами: лактозой, глюкозой, сахарозой. На плотных питательных средах нейтральной или слабо щелочной реакции капсульные бактерии дают типичные вязкие, выпуклые колонии, нередко сливающиеся в виде сплошного перламутрового слизистого слоя.

Из всех микробов капсульной группы наименее устойчивой является палочка склеромы (Klebsiella rinoscleromatis). Ценным дифференциально-диагностическим признаком этого микроба является его неустойчивость к действию желчи быка, в отличие от других видов клебсиелл. Цитраль обладает бактериоста-тическими и бактерицидными свойствами в отношении капсульной группы, причем наиболее выраженный эффект отмечен по отношению к палочке склеродермы. Сулема убивает палочки склеромы через 3 ч, фенол — через 24 ч. Нагревание до 70 °С капсульных бактерий в водной взвеси приводит к их гибели в течение часа. Капсульные бактерии отличаются значительным разнообразием антигенной структуры в связи с особенностями соматических (S и R) и капсульных (К) антигенов. В настоящее время различают более 60 капсульных типов. Палочка склеромы серологически однообразна, и все штаммы палочки склеромы входят в одну антигенную группу.

Известно несколько серотипов палочки озены {Klebsiella ozenae) (К 4, 5 и 6) и большое количество серотипов палочки Фридлендера (Klebsiella pneumoniae) с ее многочисленными капсульными антигенами. Все указанное заставляет использовать комплексно все методы исследования: данные морфологии, культуральных, биохимических и антигенных свойств, для того чтобы отнести данный штамм к определенному виду или группе внутри рода капсульных бактерий.

3. Лабораторная диагностика склеромы — основана на применении патогистологического, цитологического, бактериологического и серологических методов.

Бактериоскопическое исследование позволяет обнаружить в срезах и в препаратах-отпечатках инфильтратов типичные для склеромной гранулемы гидропические клетки Микулича, гиалиновые шары и плазматические клетки.

Бактериологическое исследование — диагностика склеромы, основана на обнаружении в слизи носа, зева, трахеи, гортани, бронхов, в кусочках, полученных путем биопсии, капсульной бактерии и выделении ее в чистой культуре. Посев делают на 2—3 чашки Петри со слабощелочным мясо-пептонным агаром или глицериновым агаром, затем пересевают культуру в цветной ряд (лактоза, глюкоза, сахароза) для определения ферментации; изучение чувствительности микробов при посеве на агар, смешанный напополам с бычьей желчью; исследование серологических свойств микробов с помощью антисыворотки-1 в реакции связывания комплемента; определение вирулентности культуры в опыте на белых мышах; изучение чувствительности выделенных микробов к лизирующему действию специфического бактериофага.

Бактериофаг палочки склеромы может быть легко обнаружен в летнее время, непосредственно после фильтрации взвеси палочки склеромы из агаровых и бульонных культур. Бактерии других капсульных микробов склеромным фагом не лизируются.

Серологическая диагностика склеромы основана на исследовании сыворотки больного в реакции связывания комплемента с антигеном из слизистой культуры палочки склеромы и реакции агглютинации с антигеном из бесслизистой культуры этого микроба.

Диагностическим титром реакции агглютинации считают титр 1: 600 (слабо положительная), а в более высоких титрах 1: 3200 как положительную. Лабораторный диагноз заболеваний, вызываемых пневмобациллой Фридлендера, основывается исключительно на данных бактериологического анализа (посев на мясо-пептонный агар с последующей дифференциацией и описание морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств выделенных микроорганизмов).