Цитогенетичний аналіз дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули.
Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) ґрунтується на мікроскопічному дослідженні структури і кількості хромосом. Він набув широкого застосування у 20-і роки XX ст, коли було отримано перші відомості про кількість хромосом у людини. У 30-х роках були ідентифіковані перші 10 пар хромосом.
У 1956 р. шведські вчені Дж. Тийо і А. Леван вперше довели, що у людини 46 хромосом.
Цитогенетичний метод використовують для:
• вивчення каріотипів організмів;
• уточнення числа хромосомних наборів, кількості і морфології хромосом для діагностики хромосомних хвороб;
• складання карт хромосом;
• для вивчення геномного і хромосомного мутаційного процесу;
• вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяціях.
Хромосомний набір людини містить велику кількість хромосом, основні відомості про які можна отримати при вивченні їх в метафазі мітозу і профазі - метафазі мейозу. Клітини людини для прямого хромосомного аналізу отримують шляхом пункції кісткового мозку і біопсії гонад, або непрямим методом - шляхом культивування клітин периферичної крові (лімфоцити), коли отримують значну кількість метафаз. Непрямим методом досліджують також клітини амніотичної рідини або фібробласти, отримані при амніоцентезі або біопсії хоріона, клітини абортусів, мертвонароджених та ін.
Частіше досліджують хромосоми в лімфоцитах периферичної гепаринізованої крові. Для стимуляції мітозу додають фітогемаглютинін, а для зупинки мітозу - колхіцин. Препарат забарвлюють ядерними барвниками: 2 % розчином ацеторсеїну, азуреозином, барвником Унна, розчином Гімза та ін. Накривають покривним скельцем, видаляють надлишок барвника фільтрувальним папером, розглядають під мікроскопом з масляною імерсією.
Останнім часом всі дослідження в цитогенетиці людини проводять із застосуванням методів диференційного забарвлення хромосом, які дозволяють відрізнити кожну хромосомну пару. Існує декілька способів забарвлення: Q, G, С, R (рис. 1.42). У вирішенні питань діагностики хромосомних хвороб різні методи диференційного забарвлення застосовують у комбінації. Завдяки диференційному забарвленню хромосом можна виявити незначні хромосомні поламки: невеликі делеції, транслокаціїта ін.
Отримавши мікропрепарат, вивчають його візуально та складають ідіограму каріотипу, тобто впорядковане розміщення кожної пари хромосом за індивідуальними ознаками відмінностей: загальна довжина хромосоми, форма, розташування центромери.
Більшість хромосом за таким методом можна тільки віднести до певних груп згідно з Денверською класифікацією
Цей метод дозволяє діагностувати багато спадкових хвороб, вивчати мутаційний процес, складні перебудови і найменші хромосомні аномалії у клітинах, які вступили у фазу поділу та поза поділом.
На хромосомний аналіз направляються пацієнти з множинними уродженими вадами розвитку, діти з затримкою фізичного і психомоторного розвитку, пацієнти з недиференційованими формами олігофренії (недоумства), з порушенням статевого диференціювання, жінки з порушенням менструального циклу (первинна або вторинна аменорея), сім'ї з безпліддям, жінки зі звичним невиношуванням вагітності (викидні, мертвонароджені).
Генетичні маркери
Для діагностики спадкових та інфекційних захворювань на рівні ДНК використовують різні методи, зокрема ДНК-зонди (маркери). ДНК-зонд - це ділянка ДНК довжиною від 10 до 6000 пар нуклеотидів, у якій послідовність основ комплементарнапослідовності досліджуваної ділянки ДНК (гена, що зумовлює захворювання, або гена вірусу, бактерії).
Технологія ДНК-зондів вимагає знання нуклеотидної послідовності гена, що досліджується. Для локалізації гена зонди, що містять радіоактивні або флуоресцентні мітки, вносяться у ДНК-зразки, що містять біологічний матеріал, отриманий від хворого. За наявності в ДНК комплементарної послідовності зонд приєднується до неї і його можна визначити, вимірюючи радіоактивність або флуоресценцію. Розміри фрагментів ДНК, до яких приєднався зонд, визначають за допомогою методики, що отримала назву блотинг, розроблена американським вченим Саузерном. За допомогою ДНК-зондів ідентифіковані деякі гени людини. Вони використовуються також для діагностики інфекційних захворювань внаслідок визначення послідовностіДНК, унікальної для кожної бактерії або віруса, наприклад, віруса гепатиту В - дуже тяжкого і поширеного захворювання людини. Послідовність нуклеотидів ДНК цього вірусу розшифрована. На даний час випускаються готові діагностичні набори, що містять одноланцюгову ДНК, мічену флуоресцентним барвником, комплементарну одному з ланцюгів вірусної ДНК. Таку одноланцюгову ДНК додають до зразка крові хворого з симптомами гепатиту В. Пробу крові нагрівають для поділу ДНК вірусу на окремі ланцюги. ДНК-зонд приєднується до комплементарного ланцюга ДНК вірусу і відновлює подвійний ланцюг ДНК. Флуоресціюючі ДНК можна побачити, знявши на фотоплівку.
Одним із важливих досягнень в області ДНК- технологій є розробка полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Використовуючи ПЛР, можна синтезувати мільйони копій одного гена або будь-яких специфічній ділянок ДНК у пробірці впродовж короткого часу ПЛР отримала свою назву від ДНК-полімерази, ферменту, що сприяє реплікації ДНК у клітині. Реакція ланцюгова, тому що полімераза буде відтворювати реплікацію кожної копії ДНК, що утворилася, нескінченну кількість разів.
Для проведення ПЛР необхідні праймери - короткі послідовності з 20 нуклеотидів, комплементарні нуклеотидам на обох кінцях ділянки ДНК-мішені Праймери необхідні для початку процесу реплікації що буде продовжений ДНК-полімеразою.
Варто зазначити, що для аналізу кожної ділянки ДНК застосовуються свої специфічні праймери. Це дало можливість значно вдосконалити і прискорити діагностику багатьох інфекційних захворювань, зробити більш доступними генетичні дослідження у медичній практиці.
