Матеріали та обладнання: пробірка з чистою культурою стафілококів на скошеному МПА, бактеріальна петля, пінцет, барвник – генціанвіолет, склограф, спиртівка, сірники, марлеві серветки, імерсійна олія, мікроскоп.
Порядок роботи та методика приготування мазка з культури, що вирощена на щільному живильному середовищі:
1. Для приготування мазка необхідно взяти чисте знежирене предметне скло.
2. Позначити місце нанесення матеріалу склографом із зворотного боку предметного скла. Предметне скло провести через полум'я спиртівки (стерилізація). Робоча поверхня повернута до полум'я.
3. Петлю прожарити в полум'ї спиртівки, тримаючи її як олівець вертикально у правій руці. Два-три рази провести через полум‘я і нижню третину петлетримача.
4. Не випускаючи петлі, лівою рукою взяти пробірку із стерильним фізіологічним розчином, а 4-м і 5-м пальцями правої руки затиснути ватно-марлеву пробку, витягнути її і краї пробірки пронести через полум’я спиртівки, не випускаючи пробки.
5. Петлю ввести у пробірку і охолодити її, торкаючись стінки.
6. Занурюючи петлю в рідину, набрати краплю фізіологічного розчину. Витягнути петлю, провести пробку та відкритий край пробірки через полум’я, після чого закрити і поставити у штатив.
7. На центр скельця бактеріологічною петлею нанести краплю фізіологічного розчину.
8. Петлю знову простерилізувати, у ліву руку взяти пробірку з культурою стафілокока, що вирощена на скошеному МПА. Відкрити пробку із дотриманням усіх правил, охолодити петлю і набрати нею невелику кількість культури ковзними рухами.
9. Петлю витягнути, а пробірку закрити і поставити у штатив.
10. Взяту культуру стафілокока нанести на скло біля краплі фізрозчину, поступово розтираючи її та емульгуючи в краплі. Отриману завись рівномірно розподілити на поверхні скла, діаметр мазка повинен бути в межах 1 – 1,5 см.
11. Мазок висушити на повітрі і зафіксувати, для цього скло провести над полум'ям спиртівки тричі так, щоб мазок був зверху.
12. Препарат пофарбувати генціанвіолетом (1-2 хвилини).
13. Після закінчення фарбування, змити барвник водою та висушити препарат.
14. Препарат мікроскопувати з використанням імерсійного об’єктива, дотримуючись усіх правил даної мікроскопії (див. роботу 3).
15. Результати мікроскопії занести до таблиці.
| Назва препарату, метод фарбування | Рисунок | Характеристика морфологічних властивостей бактерій |
| Staphylococcus epidermidis (чиста культура), фарбування генціанвіолетом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ |
Практична робота 6. «Прибирання робочого місця»
1. Привести у належний вигляд мікроскоп. Для цього підняти тубус, зняти препарат, витерти олію з об'єктива чистою марлевою серветкою, опустити конденсор, перевести револьвер у нейтральне положення і опустити тубус.
2. Вилити воду з ванночки для промивання препаратів.
3. Поставити пробірки з культурами у загальний штатив.
4. Навести загальний порядок на столі.
5. Скельця з препаратами, що приготовлені та пофарбовані правильно, залишити для колекції на залікове заняття 1.
6. Непотрібні використані скельця з препаратами опустити в ємність з дезрозчином.
7. Зробити завершальну дезінфекцію робочого стола.
8. Вимийте руки з милом і за необхідності обробіть дезрозчином.
9. Оформити протокол практичного заняття. Протокол подати на підпис викладачу після прибирання робочого місця.
Підпис чергового студента ______________
Підпис викладача ______________________
Практичне заняття ДАТА _______________
Тема. «БУДОВА бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. мікроскопічний метод діагностики збудників інфекційних захворювань»
Питання для підготовки
1. Структура бактеріальної клітини: нуклеоїд, мезосоми, рибосоми, включення, цитоплазма, цитоплазматична мембрана, клітинна стінка, джгутики. Методи їх вивчення та виявлення.
2. Мета використання складних методів забарвлення у мікробіологічній практиці.
3. Складні методи фарбування мікроорганізмів. Метод Грама. Метод Циля-Нільсена для виявлення кислотостійких бактерій.
4. Капсули: різновиди (мікрокапсула, капсула та слизовий шар), будова, функціональне значення. Методи вивчення та виявлення капсул (метод Буррі-Гінса).
5. Джгутики бактерій: будова, функції. Класифікація бактерій за типом руху, за характером розташування та кількістю джгутиків. Методи їх вивчення та виявлення.
6. Спори: будова, функції. Спороутворення у мікроорганізмів. Метод Циля-Нільсена для виявлення спор та кислотостійких бактерій.
7. Механізм взаємодії барвників зі структурами бактеріальної клітини.
8. Мікроскопічний метод діагностики збудників інфекційних захворювань: мета, принцип.
Список літератури
1. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія: підручник для студ. вищ. навч. закл. / за редакцією В.П. Широбокова. – Вінниця: Нова Книга, 2011. – С. 61 – 77.
2. П’яткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія. – К.: Вища школа, 1992. – С. 27 -38.
3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология. – М.: МИА, 2002. – С. 30 - 45.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – СПб., 2002. – С. 33 - 46.
5. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. – М.: ГЭОТАР, 2001. – С. 17 – 26, 113 – 114.
6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник/ под ред. А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 35 - 41.
7. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии / под редакцией Л. Б. Борисова. – М.: Медицина, 1993. – С. 17 – 19.
8. Клименюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: посібник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. – С. 19 – 22.
Практична робота 1. «Вивчення демонстраційних препаратів»
Ретельно вивчивши препарати, замалювати їх у таблицю, охарактеризувавши морфологічні та тинкторіальні властивості бактерій.
| Назва препарату, метод фарбування | Рисунок | Характеристика морфологічних властивостей бактерій |
| Сorynebacterium diphtheriae (чиста культура), фарбування за Грамом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ | |
| Назва препарату, метод фарбування | Рисунок | Характеристика морфологічних властивостей бактерій |
| Bordetella pertussis (чиста культура), фарбування за Грамом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ | |
| Bacillus anthracis (чиста культура), фарбування за Грамом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ | |
| Neisseria meningitidis у спинномозковій рідині, фарбування за Грамом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ | |
| Klebsiella pneumoniaе, фарбування за Буррі-Гінсом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ | |
| Clostridium tetani (збудник правця),фарбування за Цилем-Нільсеном | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ | |
| Вacillus anthracis (збудник сибірки), фарбування за Цилем-Нільсеном | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ |
Практична робота 2. «Приготування препарату із суміші культур бактерій, фарбування його за методом Грама. Мікроскопування пофарбованого препарату з використання імерсійної олії»
Складні методи фарбування необхідні для вивчення хімічного складу та анатомічних структур клітини бактерій.
Матеріали та обладнання: пробірка із сумішшю бактерій (стафілококів та кишковою паличкою), бактеріальна петля, пінцет, барвники – генціанвіолет, фуксин Пфайфера, розчин Люголя, 96% етиловий спирт, склограф, спиртівка, сірники, марлеві серветки, імерсійна олія, мікроскоп.
Порядок роботи та методика фарбування препаратів за методом Грама:
1. Взяти чисте знежирене предметне скло.
2. Позначити місце нанесення матеріалу склографом зі зворотного боку предметного скла.
3. Предметне скло провести через полум'я спиртівки (стерилізація). Робоча поверхня повернута до полум'я.
4. Приготувати фіксований препарат із суміші бактерій дотримуючись усіх правил (див. практичну роботу 4 заняття 1).
5. Пофарбувати препарат за методом Грама.
| Техніка фарбування за Грамом (модифікація Синьова) 1. На фіксований мазок покласти суху смужку фільтрувального паперу, який раніше був просочений розчином генціанвіолету. Нанести на папір 2-3 краплі води. Час фарбування - 2 хвилини. 2. Зняти папір. 3. Обробити (протравити) препарат розчином Люголя впродовж 1 хвилини. 4. Для знебарвлювання нанести на препарат спирт на 30 секунд. 5. Промити препарат водою. 6. Для додаткового фарбування налити на препарат фуксин Пфайфера (водний розчин) на 1 хвилину. 7. Промити препарат водою та просушити фільтрувальним папером. |
6. Використовуючи імерсійну олію, вивчити препарат під мікроскопом, результати мікроскопії занести до таблиці.
| Назва препарату, метод фарбування | Рисунок | Характеристика морфологічних та тинкторіальних властивостей бактерій |
| Суміш бактерій, фарбування за Грамом | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ |
Висновок: 1. Запропонована суміш бактерій має різні тинкторіальні властивості, що залежить від хімічної будови клітинної стінки цих бактерій. Поясніть у таблиці механізм фарбування за Грамом та зробіть висновок про призначення кожного компонента.
| Дослідний матеріал | Інгредієнти фарбування за Грамом та час їх дії | Призначення основних інгредієнтів | Результати (рисунки) | ||
| Фарбування за Грамом | Фарбування за Грамом без спирту | Фарбування за Грамом без розчина Люгол. | |||
| Суміш бактерій, фарбування за Грамом | Генціанвіолет – 1 хвилина | ||||
| Розчин Люголя – 1 хвилина | |||||
| Спирт – 30 секунд | |||||
| Фуксин – 1 хвилина |
Практична робота 3. «Фарбування готового фіксованого препарату із кислотостійкими мікроорганізмами за Цилем-Нільсеном. Мікроскопування препаратів з використання імерсійної олії»
Матеріали та обладнання: фіксовані препарати з мокротиння від хворого з підозрою на туберкульоз, пінцет, барвники – метиленовий синій, 5% сірчана кислота, карболовий фуксин Циля, склограф, марлеві серветки, імерсійна олія, мікроскоп.
Порядок роботи та техніка фарбування препаратів за методом Циля-Нільсена:
1. На фіксований препарат покласти суху смужку фільтрувального паперу.
2. Нанести на папір 3-4 краплі карболового фуксину Циля. Утримуючи предметне скельце пінцетом або рукою, тричі нагріти препарат над полум'ям спиртівки до появи пари. Час фарбування - 5 хвилин.
3. Після охолодження скельця зняти фільтрувальний папір із препарату та промити його водою.
4. Для знебарвлювання нанести на препарат 5% розчин сірчаної кислоти на 30 секунд.
5. Ретельно промити препарат водою.
6. Нанести на мазок декілька крапель водного розчину метиленового синього на 3-4 хвилини.
7. Промити препарат водою та просушити фільтрувальним папером.
8. Використовуючи імерсійну олію вивчити препарат під мікроскопом, результати мікроскопії занести до таблиці.
| Назва препарату, метод фарбування | Рисунок | Характеристика морфологічних та тинкторіальних властивостей бактерій |
| Mycobacterium tuberculosis у мокротинні, фарбування за Цилем-Нільсеном | ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ |
Висновки: 1. З чим пов'язана кислотостійкість бактерій?
2. В який колір фарбуються кислотостійкі бактерії та структури та нестійкі за методом Циля-Нільсена?
3. Описати механізм фарбування кислотостійких бактерій або структур бактеріальної клітини методом Циля-Нільсена.
1. ______________
________________
2. ______________
________________
3. __________________________________________________________________
____
___________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Практична робота 4. «Приготування препарату „роздавлена крапля”, мікроскопування препарату»
Матеріали та обладнання: культура джгутикових бактерій у МПБ, пінцет, предметні скельця, покривні скельця, піпетка, марлеві серветки, смужки фільтрувального паперу, імерсійна олія, мікроскоп, склянка з дезрозчином.
Порядок роботи та техніка приготування препарату „роздавлена крапля”:
1. На центр знежиреного предметного скла нанести краплю рідкої бульйонної культури, якщо культура вирощена на щільному середовища, то на предметне скло нанести краплю стерильної дистильованої води та внести до неї, за допомогою бактеріологічної петлі, невелику кількість культури бактерій, що вирощена на щільному живильному середовищі, емульгувати.
2. На дослідний матеріал покласти покривне скло так, щоб не було пухирців повітря. Краплю слід робити такої величини, щоб вона займала весь простір між покривним та предметним скельцями і не виступала за краї покривного. Якщо є надлишок рідини, то його слід видалити фільтрувальним папером, який необхідно відразу ж занурити у дезінфікуючий розчин.
3. Препарат можна розглядати як із „сухими” системами, так і з імерсійною. Тож мікроскопувати препарати необхідно, використовуючи об’єктиви 40х або 90х.
Висновок: зазначити, які типи рухів притаманні бактеріям.
________________________________
