Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕНЯ ФЕРМЕНТАТИВНИХ АКТИВНОСТІЕЙ

Методи визначення активності амілолітичного комплексу

Всі ферменти амілолітичного комплексу належать до класу гідролаз, другому підкласу - ферментам, які каталізують гідроліз глікозидних сполук і підпідкласу глікозидаз.

У комплекс ферменту амілолітичної дії входять a- і b-амілази, глюкоамілаза і комплекс ферменту, котрий зветься декстриназою.

a-амілаза /a-І, 4-глюкан-глюканогідролаза,3.2.1.1/ каталізує розрив внутрішніх a-1,4-глюкозидних зв‘язків крохмалю, тому її називають ендоамілазою. При дії a-амілази проходить розжиження крохмалю внаслідок накопичення декстринів і деякої кількості мальтози.

b-амілаза /a-1,4-глюкан-мальтогідролаза,3.2.1.2/є ферментом екзодії і гідролізує a-1,4-глюкозидні зв‘язки, і передостанні у лінійних ділянках амілози і амілопектину, послідовно відщеплюючи залишки мальтози із неридукуючого кінця ланцюга. При цьому шляхом інверсії утворюється b-мальтоза.

Глюкоамілаза або екзо-1,4-глюкозидаза /a-1,4-глюкан-глюкогідролаза, 3.2.1.3/ також є екзоферментом, гідролізує крохмаль, відщеплюючи послідовно залишки глюкози із неридукюючого кінця ланцюга. Фермент має схожість не тільки до a-1,4-глюкозидних зв’язків, але і до a-1,6-зв‘язків, які гідролізуються із значно меншою швидкістю.

Декстриназа - комплекс ферментів, котрі діють на розгалужені субстрати із великою кількістю a-1,6-зв‘язків.

Визначення амілолітичної активності колориметричним методом /АС/.

Метод заснований на гідролізі крохмалю ферментами амілолітичного комплексу до декстринів різної молекулярної маси. Кількість гідролізованого крохмалю встановлюють за зміною його кольору з йодом в результаті дії амілаз. Інтенсивність кольору з йодом вихідного крохмалю та отриманих в результаті гідролізу декстринів вимірюють на фотоелектроколориметрі.

За одиницю амілолітичної активності /АС/ прийнято таку кількість ферменту, яку в строго визначених умовах каталізують гідроліз 1г розчинного крохмалю до декстринів різної молекулярної маси. При цьому кількість прогідролізовагого крохмалю має складати не більше 30% від вихідного.

Активність препарату /амілолітична здатність/ виражається числом одиниць активності в 1г препарату.

Колориметричний метод визначення амілолітичної активності затверджений ГОСТ 20264.4-74.

Хід роботи

Ферментативну реакцію гідролізу крохмалю проводять в строго визначених стандартних умовах: температура-30⁰С, рН середовища-6,0 для бактеріальних препаратів та 4,7- для грибкових, тривалість реакції 10хв, концентрація субстрату 1%, об‘єм реакційної суміші 15мл /10мл субстрату та 5мл ферментного розчину/.

Для аналізу беруть дві пробірки діаметром 2см та висотою 18см, наливають в кожну по 10мл 1%-го розчину крохмалю і ставлять в ультратермостат з температурою 30⁰С на 10-15хв, щоб розчин досягнув температури 30⁰С.

Потім в першу пробірку наливають 5мл дистильованої води /контрольний зразок/, в другу- 5мл ферментного розчину /дослідна проба/. Суміші швидко перемішують та витримують в ультратермостаті 10хв для проведення ферментативної реакції. Потім пробірки виймають з термостату, з кожної відбирають по 0,5мл реакційної суміші і переносять в конічні колбочки, в які попередньо налито по 50мл робочого розчину йоду. Вміст колб перемішують; проходить одночасно інактивація ферменту та йод-крохмальна реакція.

Розчини отримають окраску: контрольна проба - синю, досвідна - фіолетову різної інтенсивності в залежності від ступеню гідролізу крохмалю.

Оптичні густини отриманих забарвлених розчинів визначають на фотоелектроколориметрі, використовуючи кювети з товщиною стінки 10 мм та світофільтр з довжиною світової хвилі 656нм /червоний світлофільтр/.

Виміри проводять по інструкції, прикладеної до кожного приладу. Відлік знімають по червоній шкалі лівого барабану. Отримують два значення оптичної густини: D₁- контрольного розчину, яка характеризує кількість крохмалю, взятого на ферментативну реакцію (значення D₁ має бути не менше 0,7) та D₂- досвідного розчину, яка характеризує кількість крохмалю та декстринів в реакційній суміші.

Кількість прогідролізованого крохмалю С в г визначається за формулою:

.

Якщо кількість прогідролізованого крохмалю менше 0,02 або більше 0,7, то аналіз повторюють відповідно з більшим або меншим розведенням вихідного ферментного розчину. Амілолітичну активність визначають з рівнянь, отриманих при математичній обробці експериментальних даних по вивченню залежності між кількістю взятого на аналіз ферменту та ступінню гідролізу крохмалю /в коефіцієнти введено перерахунок на 1год дії ферментів/.

Внаслідок різниць ферментних комплексів препаратів грибкового та бактеріального походження і специфічності їх дії розрахунок активності проводиться по рівнянням, які характерні тільки для аналізу даного роду ферментних препаратів.

Рівняння для розрахунку амілолітичної активності має вигляд:

для препаратів грибкового походження:

ОД/г; /І/

для препаратів бактеріального походження:

ОД/г, де /2/

С - кількість крохмалю, прогідролізованого в період реакції, г;

n- кількість ферментного препарату, взятого на аналіз, мг.

Для вираження амілолітичної активності в міжнародних одиницях отриману величину АС слід помножити на 103 стандартних міжнародних одиниць розмірністю мкмоль/хв.

Приклад розрахунку. Для аналізу беремо препарат амілорізин П10х готуємо з нього розчин. Для цього наважку 0,1г препарату переносимо в мірну колбу на 100мл і розчиняємо в дистильованій воді. Розчин доводимо до мітки теж дистильованою водою. З цього розчину готуємо робочий розчин. Для робочого розчину 2мл вихідного розчину поміщаєм в мірну колбу на 200мл і доводимо до мітки дистильованою водою. Для аналізу беремо 5мл робочого розчину в якому знаходиться 0,05 мг амілоризину П10Х. Аналіз проводимо повністю так, як приведено вище.

В результаті отримані значення оптичної густини:

D₁=0,745 і D₂=0,463.

Кількість прогідролізлваного крохмалю

г.

Тоді активність даного препарату буде

ОД/г.

Реактиви.

1.Розчин крохмалю 1% /субстрат/.

2.Ацетатний буферний розчин з рН=4,7.

3.Фосфатний буферний розчин з рН=6,0.

4.Основний розчин йоду І₂.

5.Робочий розчин йоду.

Посуд та обладнання

1.Ваги та гирі

2.Пробірки Ø=20мм, h=180мм

3.Піпетки на 1, 5 і 20 мл

4.Ультратермостат на 30^оС

5.Секундомір

6.Колби конічні на 100-250 мл

7.Мірні колби на 50 мл

8.Фотоелектроколориметр

9.Кювети з товщиною стінки 10 мм

Література: И.Грачёва и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. С.57

 

 

Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності

Крапельним методом.

Амілолітична активність визначається крапельним методом візуальним спостереженням за зміною забарвлення крохмалю з йодом при дії на крохмаль амілаз. Вона характеризує властивість каталізувати гідроліз крохмалю до незабарвлених йодом декстринів, обумовлену в основному наявністю у препараті a-амілази. При наявності у препараті b-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнята така кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до продуктів, незабарвлених йодом, за 1 год при температурі 30⁰С у суворо визначених умовах.

АС визначається числом одиниць у 1 г препарату, культури або 1 мл розчину. АС показує, скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до незабарвлених йодом продуктів 1г препарату, культури або 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Методика визначення АС залежить від гідролізу 1%-го забуференого розчину крохмалю; кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою.

Чутливість методу визначається мінімальною кількістю часу, за який можна візуально визначити зміну забарвлення йоду.

Допускають, що швидкість ферментативної реакції прямо пропорційна кількості застосованого ферменту і залишається сталою від 5хв до 1 год, тобто, реакція підпорядковується закону реакції нульового порядку.

Встановлено вплив величини рН і хімічної природи буферу на величину АС.

З ацетатним буфером рН=4,7 величина АС у грибних препаратів у середньому у 1,5 рази вище, ніж при визначенні з фосфатним (рН=4,9), тому рекомендується брати ацетатний буфер.

Прилади, посуд, реактиви

1. Пробірки великі

2. Скляні палички

3. Циліндр

4. Ультратермостат

5. Секундомір

6. Біла фарфорова пластинка

7. Ацетатний буфер.

8. 1%-й розчин розчинного крохмалю.

9. Розчин йоду.

Порядок виконання роботи

Необхідно 25 мл субстрату помістити у широку пробірку, в яку вставлена скляна паличка; 30 мл води і 30 мл витяжки налити у окремі пробірки, поставити їх у ультратермостат і витримати на протязі 10хв при температурі 30⁰С.

Потім у пробірку з крохмалем додати 1-25 мл ферментного розчину у відповідну кількість води так, щоб загальний об’єм реакційної суміші складав 50 мл.

Вміст пробірки перемішати паличкою і відмітити за секундоміром час, коли була додана витяжка до розчину крохмалю у пробірці, поміщеній у ультратермостат.Через кожні 60 с паличкою відбирати пробу у вигляді краплі. Краплю помістити на білу фарфорову пластинку, з’єднати її з краплею робочого розчину йоду і спостерігати за забарвленням. Реакція розщеплення крохмалю є закінченою, коли йод перестає змінювати забарвлення при з’єднанні з краплиною забарвленого розчину на протязі перших 10с. Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, незабарвлених йодом, повинен бути 10-12хв.В іншому випадку аналіз необхідно повторити з більшою чи з меншою кількістю розчину ферменту.

Амілолітична активність ферментних матеріалів

АС= од./г або мл,

де 0,25-кількість крохмалю, яка знаходиться в 25 мл його 1%-го розчину, г;

60- перерахунок на одиницю часу, 1год;

- кількість ферменту, яка бере участь в реакціях, г або мл. Ця величина визначається з урахуванням концентрації вихідної витяжки і наступного розведення; - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до незабарвлених йодом продуктів.

Приклад. Вихідний розчин ферменту приготовлений із розрахунку 5г культури гриба на 100 мл забуференої води. Культура дуже активна, тому потрібно додаткове розведення: 20 мл вихідного розчину доведено в мірній колбі до 50 мл дистильованою водою і звідти на аналіз взято 2 мл, тобто, отримали ланцюг розведень.

5г - 100мл - 20мл - 50мл - 2мл.

Для проведення гідролізу 0,25 г крохмалю 2 мл ферментного розчину останнього розведення потрібно 12хв. Тоді

АС= од. АС/г.

У даному випадку, враховуючи всі розведення,

.

При перерахунку на 1г вихідної повітряно-сухої культури.