В практике лабораторного контроля при осуществлении госсаннадзора все большее применение находят физико-химические методы исследования. Физико-химические методы анализа основаны на взаимосвязи между составом системы и ее физическими и физико-химическими свойствами.
Функциональная зависимость между численным значением данного физического или физико-химического свойства и содержанием анализируемого вещества может быть выражена графиком или формулой.
Основой для построения градуировочного графика является приготовление стандартных растворов.
Стандартные растворы необходимо готовить из аттестованных государственных образцов(ГСО).Если таковых не имеется, необходимо четко придерживаться основных требований к точности приготовления стандартных растворов:
· следует применять соединения квалификации не ниже чда;
· использование реактивов с просроченным сроком годности недопустимо;
· для приготовления стандартных растворов использовать только гостированную мерную посуду.
Особое внимание обратить на условия и сроки хранения растворов с содержанием вещества1 мг/см3 хранят 1 год, 0,1 мг/см3– 3месяца (если нет других указаний, а также если нет помутнения, хлопьев,осадка), растворы с меньшим содержанием применяются свежеприготовленными.Стандартные растворы фильтровать не допускается.
Для определения содержания вещества методом градуировочного графика готовят3 серии шкал стандартов. указания по приготовлению шкалы стандартов конкретно оговорены в каждой методике.
Обращаю Ваше внимание, что при приготовлении параллельных шкал рабочие растворы готовят соответствующим разбавлением основного стандартного раствора, который готовится из одной взятой навески или ГСО.
Градуировочный график строят на миллиметровой бумаге, откладывая на оси абсцисс,указанную в методике определения концентрацию, а по оси ординат – измеренные значения оптической плотности.
Количественное значение оптической плотности для каждой точки градуировочного графика определяется как среднее арифметическое результатов параллельных измерений 3-х шкал.
С целью уменьшения погрешности графического измерения, необходимо подобрать такой масштаб графика, чтобы угол его наклона приблизительно равнялся 45о.
Градуировочный график должен нести следующую информацию:
· название определения;
· НД на метод проведения исследования;
· метод определения;
· марка КФК,его заводской номер;
· длина волны;
· длина рабочей грани кюветы;
· раствор сравнения(растворитель, нулевой раствор и т.д.), т.е. относительно чего снимались показания испытуемого раствора;
· дата построения;
· даты поверки;
· на графике должны присутствовать данные 3-х параллельных измерений и среднее арифметическое значение (в виде таблицы).
Градуировочный график строится один раз в год и после ремонта прибора. Поверка графика должна проводиться 1 раз в квартал (если нет других указаний в методике определения.. Поверка проводится по 3-м точкам графика наиболее часто встречающихся в работе концентраций. Данные поверки заносятся в журнал поверок градуировочных графиков или наносятся на обратную сторону графика в виде таблицы.
При построении градуировочного график должна соблюдаться прямая зависимость между оптической плотностью и концентрацией. Прямолинейность графика сохраняется только в интервале концентраций, указанных в методике. Поэтому продлевать градуировочную прямую выше последней указанной в методике точки не допустимо.Находить значение концентраций испытуемого раствора по градуировочному графику ниже первой точки графика не рекомендуется, т.к. это определение несет большую погрешность. В таком случае результат исследования следует записывать в виде"менее... мг/дмз".
Несмотря на простоту и удобство, практическое использование градуировочных графиков в ряде случаев вносит дополнительную погрешность при определении концентрации растворов как за счет субъективного построения графической зависимости, так и за счет несоответствия графичеких (масштабных) погрешностей и погрешностей измерения оптических плотностей. Поэтому для получения более объективных результатов в фотометрическом анализе целесообразно построение градуировочного графика методом регрессивного анализа (уравнение регрессии).
В практике для построения градуировочных графиков и расчета коэффициента уравнения регрессии используется метод наименьших квадратов, который имеет погрешность 1–5% при доверительной вероятности 
.В связи с этим в фотоэлектроколориметрии при построении градуировочных графиков применяется метод наименьших квадратов.
Точная зависимость между концентрацией определяемого ингредиента (Х) и оптической плотностью (Y) будет выражаться уравнением: y=a+bх (I),
которое называется уравнением регрессии или уравнением градуировочного графика.На градуировочном графике это уравнение представляет уравнение прямой.Первая и последняя точка отрезка есть диапазон определения, регламентируемый данной методикой.
Для расчета коэффициентов а и bуравнения(I) весь расчетный материал сводят в таблицу.
| Nп/п | Х | Y1 | Y2 | Y3 | Yср | XY | X2 | Yрасч |
| 
| 
| 
| 
|
| Коэффициент b рассчитывают по формуле: | 
| (II) | ||
| Коэффициент a рассчитывают по формуле: | 
| (III) |
| где |
| - | сумма концентраций определяемого ингредиента во всех стандартных растворах, начиная с первого и заканчивая последним; |
|
| - | сумма квадратов вышеуказанных концентраций; | |
|
| - | сумма произведений концентрации определяемого ингредиента, умноженного на его оптическую плотность во всех стандартных растворах; | |
| - | сумма концентраций определяемого ингредиента в вышеуказанных стандартных, возведенная в квадрат; | |
|
| - | сумма оптических плотностей всех стандартных растворов. |
Пример. Для построения градуировочного графика было приготовлено 6 стандартных растворов.Набранный после фотометрирования на фотоэлектроколориметре материал свели в таблицу:
| Nп/п | Х | Y1 | Y2 | Y3 | Yср | XY | X2 | Yрасч | Р,% | 
|
| 5,0 | 0,022 | 0,021 | 0,021 | 0,0213 | 0,1065 | 0,0231 | 4,65 | -7,79 | ||
| 10,0 | 0,043 | 0,044 | 0,044 | 0,0437 | 0,4370 | 0,0391 | 2,30 | 11,76 | ||
| 30,0 | 0,096 | 0,094 | 0,095 | 0,095 | 2,8500 | 0,1031 | 2,11 | -7,86 | ||
| 50,0 | 0,171 | 0,170 | 0,171 | 0,1707 | 8,5350 | 0,1671 | 0,59 | 2,15 | ||
| 70,0 | 0,226 | 0,225 | 0,224 | 0,2250 | 15,7500 | 0,2311 | 0,89 | -2,64 | ||
| 100,0 | 0,324 | 0,324 | 0,324 | 0,3240 | 32,4000 | 0,3271 | 0,00 | -0,95 | ||
|  265
|  0,8797
|  60,0785
|  18425
|
Рассчитали значение коэффициентов а и впо формулам (II) и (III):
|
|
Уравнение градуировочного графика(I) после подстановки в него значений коэффициентов аи в будет иметь вид:
y=0,0071+0,0032х
Подставляя в это уравнение значения концентрации (5,0; 10,0; 30,0; 50,0; 70,0; 100,0)получают расчетные значения оптических плотностей yрасч(0,0231; 0,0391; 0,1031; 0,1671; 0,2311; 0,3271).
Откладывая на оси абсцисс значения концентрации, а по оси ординат расчетные значения оптических плотностей, по данному уравнению строят градуировочный график.
Полученное уравнение градуировочного графика можно использовать для обсчета результатов исследования.Для этого значение измеренной оптической плотности (y) подставляют в уравнение и рассчитывают х:
| , в нашем случае | 
|
Результат,найденный по уравнению регрессии или по градуировочному графику необходимо подставить в формулу обработки результатов, приведенную в методике определения.
Для контроля аналитической работы получение более точных результатов параллельно определяют и вычисляют сходимость результатов (Р,%), т.е. качество измерений, отражающих близость друг к другу результатов, полученных в одинаковых условиях.
Расчет погрешности между параллельными исследованиями (y1,y2,y3) следует производить по следующей формуле:
|
где А1- больший результат из параллельных определений,
А2-меньший результат из параллельных определений.
Для большинства макрокомпонентов,содержание которых в воде более 10 мг/дм3,рекомендуется значение сходимости до 10%, с содержанием от 10 до 1 мг/дм3– 10–15%, от 1 до 0,01 мг/дм3 – 15–25%, менее0,01 мг/дм3 – 30%.
Расчет воспроизводимости (относительной погрешности между yср и yрасч)производится по формуле:
|
При этом воспроизводимость результатов не должна превышать +15% (показано практикой при фотометрических измерениях с доверительной вероятностью ).
Метод наименьших квадратов (МНК, англ. Ordinary Least Squares, OLS) — математический метод, применяемый для решения различных задач, основанный на минимизации суммы квадратов отклонений некоторых функций от искомых переменных. Он может использоваться для «решения» переопределенных систем уравнений (когда количество уравнений превышает количество неизвестных), для поиска решения в случае обычных (не переопределенных) нелинейных систем уравнений, для аппроксимации точечных значений некоторой функции. МНК является одним из базовых методов регрессионного анализа для оценки неизвестных параметров регрессионных моделей по выборочным данным.
