Цикл Кальвина можно разделить на фазы

Первая фаза — карбоксилирование. Эта реакция катализируется специфическим для процесса фотосинтеза ферментом рибулозобисфосфат-карбоксилазой/ оксигеназой (сокращенно РБФ-карбоксилаза/оксигеназа), в научной литературе последних лет чаще встречается под названием Rubisco, от ribulosobiphosphatecarboxylase/oxygenase. Впервые Rubisco был выделен и очищен в 1955 году. Особенностью фермента является то, что катализируемая им реакция является самой медленной стадией в цикле фиксации углекислоты. В листьях Rubisco содержится в больших количествах и является основной фракцией белка хлоропластов. Более того, высказывается мнение, что это самый распространенный белок-фермент на земном шаре. В активное состояние фермент переходит при освещении хлоропластов. Уже отмечалось, что формирование этого фермента происходит под контролем двух геномов: большие субъединицы (54 кДа) кодируются в ядре, синтезируются в цитоплазме; малые — кодируются и синтезируются в хлоропласте. При взаимодействии РБФ с С0₂ образуется сначала промежуточное нестойкое шестиуглеродное соединение, которое затем распадается на две молекулы ФГК. Образовавшаяся ФГК — это органическая кислота, и ее энергетический уровень ниже уровня Сахаров. Поэтому это соединение не может непосредственно превращаться в углеводы. Необходимо превращение его в трехуглеродный сахар — фосфоглицериновый альдегид (ФГА).

Вторая фаза — восстановление. Дальнейшие превращения ФГК требуют участия продуктов световой фазы фотосинтеза: АТФ и НАДФН + Н⁺. Реакция идет в два этапа. Прежде всего, происходит реакция фосфорилирования 3-ФГК. Донором фосфатной группы является АТФ. АТФ требуется здесь в качестве дополнительного источника энергии. Образуется 1,3-дифосфоглицериновая кислота. Реакция катализируется ферментом фосфоглицерокиназой:

Образовавшееся в этой реакции соединение — дифосфоглицериновая кислота — обладает более высокой реакционной способностью, содержит макроэргическую связь, полученную от АТФ. Затем карбоксильная группировка этого соединения восстанавливается до альдегидной с помощью триозофосфатдегидрогеназы, коферментом которой служит НАДФ.

Образовавшийся ФГА является по уровню восстановленным углеводом. Это соединение вступает в две последние фазы. Пять молекул ФГА используется на регенерацию акцептора РБФ для того, чтобы фиксация С0₂ могла снова осуществляться. Оставшаяся шестая молекула вступает в фазу «синтеза продуктов», где превращается в более сложные соединения (углеводы, аминокислоты и др.).

Третья фаза — регенерация. В процессе регенерации акцептора используется пять молекул ФГА, в результате чего образуются три молекулы рибулезо-5-фос-фата. Этот процесс идет через образование 4-, 5-, 6-, 7-углеродных соединений. Прежде всего, первая молекула ФГА изомеризуется до фосфодиоксиацетона. Процесс катализируется ферментом триозофосфатизомеразой. От ФДФ отщепляется фосфат, и ФДФ превращается во фруктозо-6-фосфат (ф-6-Ф). Далее от Ф-6-Ф (С₆) отщепляется 2-углеродный фрагмент (—СО—СН₂ОН), который переносится на следующую (третью) триозу. Это транскетолазная реакция идет при участии фермента транскетолазы. В результате образуется первая пентоза (С₅)-рибулезофосфат. От Ф-6-Ф остается 4-углеродный сахар эритрозофосфат фосфорилирование. Для этого используются три молекулы АТФ, образовавшиеся в результате световых реакций. Все реакции, входящие в цикл Образовавшийся триозофосфат (ФГА) вступает в четвертую стадию темновых реакций — стадию образования продуктов фотосинтеза. (С₄), который конденсируется с четвертой триозой с образованием седогептулезодифосфата (С₇). После отщепления фосфата седогептулезодифосфат превращается в седогептулезофосфат. Далее снова происходит транскетолазная реакция, в результате которой от седогептулезофосфата отщепляется 2-углеродный фрагмент, который переносится на пятую триозу Образуются еще две молекулы рибулезофосфата. Таким образом, в результате рассмотренных реакций получаются 3 молекулы рибулезофосфата. При прохождении двух циклов из 12 молекул образовавшегося ФГА две молекулы выходят из них, образуя одну молекулу фруктозодифосфата (ФДФ). Из двух молекул фруктозодифосфата (Ф-1, 6-диФ) образуются фруктозо-6-фосфат (ф-6-Ф) и глюкозо-1-фосфат (Г-1-Ф). Глюкозо-1-фосфат, взаимодействуя с уридинтрифосфатом (УТФ), дает уридиндифосфоглюкозу (УДФГ). В свою очередь УДФГ, реагируя с Ф-6-Ф, дает сахарозофосфат. По-видимому, именно сахароза является первым свободным сахаром, образующимся в процессе фотосинтеза. Из сахарозы образуются нефосфорилированные моносахара (глюкоза и фруктоза). Крахмал образуется из аденозиндифосфоглюкозы (АДФГ) или уридиндифосфоглюкозы (УДФГ), процесс катализируется ферментом амилосинтетазой. Среди первых продуктов фотосинтеза обнаружены аминокислоты. По-видимому, ФГК, образовавшаяся на первом этапе цикла Кальвина, может превращаться в пировиноградную кислоту. Этот процесс идет особенно интенсивно при недостатке НАДФН, из-за чего задерживается преобразование ФГК в ФГА (обычный путь в цикле Кальвина). Пировиноградная кислота в присутствии NH3 дает аминокислоту аланин. Показано, что скорость включения ¹⁴С0₂ в аланин в клетках хлореллы при некоторых условиях может даже превышать скорость ее включения в сахарозу. Из пировиноградной кислоты может образоваться еще ряд органических кислот (в цикле Кребса).

Образовавшиеся органические кислоты в процессе аминирования или переаминирования дают аминокислоты. Сам по себе синтез аминокислот еще не означает образование белков. Однако было показано, что между этими двумя процессами имеется прямая связь. Так, под влиянием освещения синими лучами (458—480 нм) усиливается фотосинтетическое образование, как аминокислот, так и белков. В присутствии ингибиторов синтеза белка действие синего света не проявляется. Наконец, из промежуточных продуктов цикла Кальвина могут образовываться жиры, липиды и другие продукты. Состав продуктов, образующихся при фотосинтезе, может быть определен исходя из величин фотосинтетического коэффициента. Под фотосинтетическим коэффициентом понимается отношение выделенного в процессе фотосинтеза кислорода к поглощенному С0₂. Если в процессе фотосинтеза образуются углеводы, то, согласно приведенному суммарному уравнению, фотосинтетический коэффициент должен быть равен единице: 60₂/6С0₂ = 1. При образовании соединений, более восстановленных (содержащих меньше кислорода) по сравнению с углеводами, фотосинтетический коэффициент должен быть больше единицы. В случае образования белков фотосинтетический коэффициент равен 1,25, в случае жира — 1,44. Средняя величина фотосинтетического коэффициента для 27 видов растений оказалась равной 1,04. Расчеты показали, что такая величина фотосинтетического коэффициента указывает на образование наряду с углеводами некоторого количества белка (примерно 12%). Установлено, что величина фотосинтетического коэффициента меняется в зависимости от условий. Преобладание синих лучей над красными приводит к увеличению доли образующихся белков, тогда как красный свет благоприятствует образованию углеводов (Н.П. Воскресенская). Усиление снабжения растений азотом, естественно, также приводит к повышению фотосинтетического коэффициента и увеличению первичного синтеза белка. Имеются данные, что на качество продуктов фотосинтеза оказывает влияние интенсивность освещения. При высокой освещенности образуется больше углеводов, а при пониженной — аминокислот.

Таким образом, изменяя условия среды, можно регулировать соотношение продуктов фотосинтеза. Указанные закономерности имеют большое не только теоретическое, но и практическое значение, так как позволяют направленно регулировать химический состав сельскохозяйственных растений и создавать условия для преимущественного синтеза углеводов, белков или жиров (А.А. Ничипорович). Выяснение механизма регуляции образования тех или иных продуктов фотосинтеза дает возможность улучшить состав сельскохозяйственных культур. Примером в этом отношении могут служить опыты с одноклеточной водорослью хлореллой, у которой удалось повысить содержание аминокислот и жиров за счет снижения содержания углеводов путем добавления в питательную среду NH₄Cl (10^-3 М). Все же основным продуктом фотосинтеза являются сахара. В связи с этим можно следующим образом расшифровать суммарное уравнение фотосинтеза. На основании приведенных реакций можно рассчитать энергетический баланс цикла Кальвина. Для восстановления шести молекул С0₂ до уровня углеводов (глюкозы) требуется 18 молекул АТФ и 12 НАДФН. Соответственно для восстановления до уровня углеводов одной молекулы С0₂ необходимы три молекулы АТФ и две НАДФН. Как мы видели, для образования двух молекул НАДФН и двух молекул АТФ необходимо 8 квантов света. Недостающее количество АТФ образуется в процессе циклического фотофосфорилирования. Следовательно, для восстановления одной молекулы С0₂ до уровня углеводов должно быть затрачено 8—9 квантов. Энергия квантов красного света равна 168 кДж/моль. Таким образом, при использовании квантов красного света на восстановление одной молекулы С0₂ до уровня углеводов затрачивается примерно 1340— 1508 кДж. Из этой энергии в 1/6 моль гексозы откладывается 478 кДж. КПД фотосинтеза в этом случае должен составить около 30—35%. Однако в естественных условиях коэффициент использования света значительно меньше.

В отличие от ферментов, принимающих участие в цепи переноса электронов (световая фаза фотосинтеза), ферменты цикла Кальвина локализованы в строме хлоропластов. Согласованному осуществлению всех реакций способствует то, что эти ферменты часто ассоциированы на поверхности мембран и составляют определенные фотосинтеза образуются углеводы, то, согласно приведенному суммарному уравнению, фотосинтетический коэффициент должен быть равен единице: 60₂/6С0₂ = 1. При образовании соединений, более восстановленных (содержащих меньше кислорода) по сравнению с углеводами, фотосинтетический коэффициент должен быть больше единицы. В случае образования белков фотосинтетический коэффициент равен 1,25, в случае жира — 1,44. Средняя величина фотосинтетического коэффициента для 27 видов растений оказалась равной 1,04. Расчеты показали, что такая величина фотосинтетического коэффициента указывает на образование наряду с углеводами некоторого количества белка (примерно 12%). Установлено, что величина фотосинтетического коэффициента меняется в зависимости от условий. Преобладание синих лучей над красными приводит к увеличению доли образующихся белков, тогда как красный свет благоприятствует образованию углеводов (Н.П. Воскресенская). Усиление снабжения растений азотом, естественно, также приводит к повышению фотосинтетического коэффициента и увеличению первичного синтеза белка. Имеются данные, что на качество продуктов фотосинтеза оказывает влияние интенсивность освещения. При высокой освещенности образуется больше углеводов, а при пониженной — аминокислот. Таким образом, изменяя условия среды, можно регулировать соотношение продуктов фотосинтеза. Указанные закономерности имеют большое не только теоретическое, но и практическое значение, так как позволяют направленно регулировать химический состав сельскохозяйственных растений и создавать условия для преимущественного синтеза углеводов, белков или жиров (А.А. Ничипорович). Выяснение механизма регуляции образования тех или иных продуктов фотосинтеза дает возможность улучшить состав сельскохозяйственных культур. Примером в этом отношении могут служить опыты с одноклеточной водорослью хлореллой, у которой удалось повысить содержание аминокислот и жиров за счет снижения содержания углеводов путем добавления в питательную среду NH₄Cl (10^-3 М).

Все же основным продуктом фотосинтеза являются сахара. В связи с этим можно следующим образом расшифровать суммарное уравнение фотосинтеза. На основании приведенных реакций можно рассчитать энергетический баланс цикла Кальвина. Для восстановления шести молекул С0₂ до уровня углеводов (глюкозы) требуется 18 молекул АТФ и 12 НАДФН. Соответственно для восстановления до уровня углеводов одной молекулы С0₂ необходимы три молекулы АТФ и две НАДФН. Как мы видели, для образования двух молекул НАДФН и двух молекул АТФ необходимо 8 квантов света. Недостающее количество АТФ образуется в процессе циклического фотофосфорилирования. Следовательно, для восстановления одной молекулы С0₂ до уровня углеводов должно быть затрачено 8—9 квантов. Энергия квантов красного света равна 168 кДж/моль. Таким образом, при использовании квантов красного света на восстановление одной молекулы С0₂ до уровня углеводов затрачивается примерно 1340— 1508 кДж. Из этой энергии в у6 моль гексозы откладывается 478 кДж. КПД фотосинтеза в этом случае должен составить около 30—35%. Однако в естественных условиях коэффициент использования света значительно меньше. В отличие от ферментов, принимающих участие в цепи переноса электронов (световая фаза фотосинтеза), ферменты цикла Кальвина локализованы в строме хлоропластов. Согласованному осуществлению всех реакций способствует то, что эти ферменты часто ассоциированы на поверхности мембран и составляют определенные ансамбли. Путь ассимиляции углерода при фотосинтезе, установленный Кальвином и предложенный в виде цикла Кальвина, является общим для всех автотрофных организмов. Однако существуют разные пути передачи С0₂ в цикл Кальвина. Так, австралийские ученые М.Д. Хетч и К.Р. Слэк (1966) и советский ученый Ю.С. Карпилов (1960) показали, что у некоторых растений, преимущественно тропических и субтропических (в том числе кукуруза, сахарный тростник, амарант, просо, сорго), фотосинтез идет несколько по-иному. В этом случае первым продуктом карбоксилирования является соединение, содержащее 4 атома углерода. Поэтому этот путь получил название С4-пути, в отличие от цикла Кальвина, в котором образуется ФГК, содержащая 3 атома углерода (С3-путь).

Существует еще одна группа растений, имеющая особенности в осуществлении первичной фиксации С02. Это суккуленты, в частности кактусы и растения семейства Толстянковые (Crassulaceae). Поэтому этот тип фотосинтеза получил название Crassulaceae acid metabolism или САМ-метаболизм (САМ-путь). При функционировании САМ-пути устьица растений закрыты днем, когда интенсивность транспирации максимальна, и открыты ночью, когда потери воды ми­нимальны. Это предохраняет растения от излишней потери воды, повышает их устойчивость к засухе. Химизм фиксации С02 при САМ-пути сходен с С4-путем, однако если у С4-растений фотосинтез разделен в пространстве, то при САМ-пути — во времени. У САМ-растений фиксация С02 происходит в ночное время, когда устьица открыты. С02 поступает в клетки листа и в цитоплазме при участии ФЕП-карбоксилазы присоединяется к фосфоенолпировиноградной кислоте (ФЕП) с образованием органических кислот (щавелевоуксусной кислоты). ЩУК восстанавливается до яблочной кислоты, которая накапливается в вакуолях клеток листа. Реакция идет при участии фермента малатдегидрогеназы (малик-фермент). Днем на свету, когда устьица закрыты, яблочная кислота транспортируется из вакуолей в цитоплазму, где происходит декарбоксилирование ЩУК с образованием С02 и пировиноградной кислоты. С02 передвигается в хлоропласта и с помощью РБФ-карбоксилазы/оксигеназы вступает в цикл Кальвина. Таким образом, в клетках этих растений содержится как ФЕП-карбоксилаза, так и РБФ-карбоксилаза/оксигеназа. Синтезируемые в дневные часы в цикле Кальвина углеводы используются как источники метаболитов (например, ФЕП), необходимых для повторения цикла.

Осуществление фотосинтеза по такому пути позволяет растениям максимально экономить воду и поддерживать процесс фотосинтеза в условиях острого водного дефицита. Однако САМ-путь не может обеспечить высокой продуктивности растений, поэтому данные растения медленно растут и не могут конкурировать с С3- и С4-растениями при менее экстремальных условиях. Возможна смена путей фиксации С02. При достаточном количестве воды растения с САМ-метаболизмом могут переходить на С3-путь. Так, показана способность Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка) менять направленность метаболических процессов, переходя с С3-пути фотосинтеза на САМ в условиях действия различных стрессоров: водного, солевого, температурного. В научной литературе имеются указания о наличии и других путей связывания С02. Однако они еще недостаточно изучены. Важно также подчеркнуть, что на всех этапах фотосинтетического цикла промежуточные продукты могут претерпевать различные превращения в зависимости от условий среды. Именно это является основой для образования разнообразных продуктов фотосинтеза.

Исследования показали, что в растениях, в которых процесс фотосинтеза протекает по С4-пути, имеются два типа клеток и хлоропластов:

1) мелкие гранальные пластиды в клетках мезофилла листа;

2) крупные пластиды, часто лишенные гран, в клетках обкладки, окружающих сосудистые пучки.

Клетки обкладки имеют утолщенные клеточные стенки, содержат большое количество хлоропластов и митохондрий, расположены вокруг сосудистых пучков в 1 или 2 слоя. Совокупность указанных особенностей анатомического строения получила название корончатой анатомии или корончатого синдрома (от слова kranz — корона). Хлоропласты разных типов клеток характеризуются не только особенностями строения, но и разным типам фосфорилирования. В клетках мезофилла по преимуществу происходит нециклическое фосфорилирование и образуется НАДФН, необходимый для цикла Кальвина, идущего в клетках обкладки. В хлоропластах клеток обкладки идет только циклическое фосфорилирование. Такое разделение типов фосфорилирования, возможно, связано с тем, что к хлоропластам клеток обкладки, расположенным в глубине листа, проникает по преимуществу более длинноволновый свет, который не поглощается фотосистемой, ответственной за разложение Н20. На первом этапе С4-пути углекислый газ, диффундирующий в лист через устьица, попадает в цитоплазму клеток мезофилла с мелкими хлоропластами, в которых и происходит реакция карбоксилирования фосфоенолпировиноградной кислоты (феп):

Реакция катализируется ферментом фосфоенолпируваткарбоксилазой (фепкарбоксилазой) с образованием щавелевоуксусной кислоты (оксалоацетат). ЩУК преобразуется в яблочную кислоту (малат) или аспарагиновую (аспартат). Восстановление до маната происходит в присутствии НАДФН, а для образования аспартата необходимо наличие NH4+. Затем яблочная (или аспарагиновая) кислота, по-видимому, по плазмодесмам передвигается в клетки обкладки. В клетках обкладки яблочная кислота декарбоксилируется ферментом малатдегидрогеназой до пировиноградной кислоты (пируват) и С02. Реакция декарбоксилирования может варьировать у разных групп растений с использованием разных ферментов. С02 поступает в хлоропласты клеток обкладки и включается в цикл Кальвина—присоединяется к РБФ. Пируват возвращается в клетки мезофилла и превращается в первичный акцептор С02 — ФЕП. Таким образом, при С4-пути реакция карбоксилирования происходит дважды. Это позволяет растению создавать запасы углерода в клетках. Акцепторы С02 (ФЕП и РБФ) регенерируют, что и создает возможность непрерывного функционирования циклов. Фиксация С02 с участием ФЕП и образованием малата или аспартата служит своеобразным насосом для поставки С02 в хлоропласты обкладки, функционирующих по С3-пути. Поскольку при таком механизме фотосинтеза принимают участие два типа клеток и два типа хлоропластов, этот путь называют еще кооперативным (Ю.С. Карпилов, 1970). Высказывается мнение, что С4-путь возник в процессе эволюции как приспособление к изменившимся условиям среды. При возникновении фотосинтеза атмосфера была значительно богаче С02 и беднее 02. Именно поэтому важнейший фермент цикла Кальвина Rubisco (РБФ-карбоксилаза/оксигеназа) может работать только при сравнительно высоких концентрациях С02. Благодаря деятельности самих растений состав атмосферы изменился: содержание С02 резко уменьшилось, а 02 возросло. В изменившихся условиях в осуществлении темновых реакций фотосинтеза появился ряд приспособительных черт. В частности значительно увеличилось содержание фермента Rubisco, который составляет почти половину белков стромы хлоропластов. Вместе с тем у некоторых растений выработался особый, дополнительный путь связывания С02 с помощью ФЕП-карбоксил.