Классическими методами экспериментальной онкологии являются следующие:
1. Трансплантация опухоли (Новинский 1876 год у щенков, хотя идея трансплантации опухоли принадлежит Р. Вирхову);
2. Эксплантация - выращивание опухоли в культуре ткани;
3. Индукции опухоли, т.е. применением химических (Ишикава, Ямагива, Л.М. Шабад), физических и биологических канцерогенов. Так, Л.А. Зильбер, Эллерман и Банг вызвали лейкоз у кур, вводя им бесклеточный фильтрат или то же самое мышам (Гросс), либо фактор молока у новорожденных мышей - рак молочной железы.
ПАТОГЕНЕЗ
Механизм канцерогенеза, включающий в себя приобретение клеткой опухолевой программы с последующим безудержным разрастанием (патологическая гиперплазия), - процесс сложный, длительный и многоэтапный. Он может тянуться десятилетиями. На первом этапе происходит превращение нормальной клетки в опухолевую, получившее наименование бластомоцитогенеза. Второй этап связан с превращением опухолевой клетки в опухолевую ткань – рак, когда идет интенсивное накопление массы опухолевых клеток (1 г опухоли содержит приблизительно 1 млрд. клеток). Этот процесс получил наименование бластомогенеза.
На первом этапе – этапе бластомоцитогенеза выделяют две стадии:
1) трансформация нормальной клетки в опухолевую, т.е. приобретение клеткой онкогенной программы. Этот этап предположительно длится от нескольких лет до нескольких десятков лет (10-30 лет).
2) активация, или промоция, когда происходит реализация онкогенной программы, которая без повторного действия канцерогена невозможна.
Чаще всего опухолевый генотип (специфическая мутация) появляется при вступлении делящейся клетки в фазу S (фаза синтеза) или M (фаза митоза).
Для объяснения механизма превращения нормальной клетки в опухолевую (т.е. трансформации обычной клетки в раковую) предложены две теории – генетическая и эпигеномная, суть которых сводится к нестабильности генома клетки и стойким и необратимым его изменениям. Неопровержимыми доказательствами верности постулируемого положения являются классические опыты с перевивкой штаммов разных опухолей. Парентеральное введение клеток таких опухолей экспериментальным животным приводит к развитию соответствующей опухоли (т.е. образованию новых, подобных себе клеток) в их организме, несмотря на то, что опухолевые клетки попадают в совершенно новую для них среду со свойственными ей иммунными, биохимическими и нейрогуморальными особенностями. Размножение опухолевых клеток с исходом в опухоль может продолжаться теоретически бесконечно. Примерами могут служить перевиваемые в течение почти 100 лет карцинома Эрлиха (с 1905 г.), саркомы Иенсена (с 1907 г.) и другие, которые после каждой трансплантации образуют себе подобные злокачественные опухоли.
Приведенные опыты показывают, что стимул к беспредельному делению клеточного материала заложен в самих опухолевых клетках, а не в окружающей их среде. Учитывая, что признаки злокачественности передаются раковыми клетками из поколения в поколение, можно считать доказанным, что признаки злокачественности закодированы в геноме самих опухолевых клеток, и, следовательно, опухолевый процесс - это болезнь генома клетки.
В настоящее время предложено большое количество теорий, пытающихся объяснить механизмы канцерогенеза. Наиболее значимыми среди них являются следующие:
1. Мутационная теория (Г. Бовери), согласно которой в основе трансформации нормальной клетки в опухолевую лежит мутация.
2. Эпигеномная теория (К. Гейдельберг с соавт.). В соответствии с данной теорией трансформация нормальной клетки в опухолевую не связана с мутациями генов, т.е. изменениями или повреждениями их структуры, а обусловлена одновременно сосуществующими репрессией генов, тормозящих деление клеток, и дерепрессией генов, стимулирующих их деление. Это естественно ведет к безудержному делению клеток и передаче их эпигеномных изменений по наследству.
3. Вирусно-генетическая теория (Л.А. Зильбер с соавт.), согласно которой опухолевая трансформация связана с внедрением в клеточный геном вирусной ДНК (или ДНК-копий вирусной РНК).
4. Теория эндогенных вирусов (Р. Хьюбнер, Г. Тодаро). По этой теории, вирусные гены, или онкогены, пребывают в клеточном геноме человека и животных в репрессированном состоянии на протяжении всей жизни организма и передаются по наследству как обычные клеточные гены. Вирусные онкогены могут быть активированы воздействием любого канцерогена, результатом чего может быть превращение нормальной клетки в опухолевую. Полагают, что эти эндогенные вирусы представляют собой бывшие экзогенные онкорнавирусы, внедрившие на ранних этапах эволюции в клеточный геном всех многоклеточных организмов. После инфицирования клеток вирусная РНК через собственную транскриптазу синтезировала ДНК-копии, оказавшиеся в геноме и оставшиеся здесь навсегда в латентном состоянии.
5. Теория образования опухолеродных генов – протовирусов (Н. Темин, Д. Балтимор). Согласно этой гипотезе при обычных нормальных условиях на матрицах РНК с помощью клеточной ревертазы происходит синтез копий ДНК, необходимой для усиления функций нормальных генов. Воздействие канцерогенов приводит к нарушению и изменениям структуры РНК-матриц, что ведет к синтезу ими мутантных ДНК-копий. Эти мутантные ДНК-копии в потенции могут становиться матрицей для образования эндогенного РНК-вируса (отсюда название для мутантных ДНК-копий – протовирусы). Последние включаются в клеточный геном и вызывают опухолевую трансформацию клетки.
6. Теория недостаточности репарации ДНК (М.М. Виленчик). Согласно этой теории клеточная ДНК даже в нормальных условиях постоянно подвергается агрессивным воздействиям со стороны экзогенных и эндогенных мутагенов, вызывающих ее повреждение и образование мутантных, в том числе опухолеродных, генов. В подавляющем большинстве случаев при этом опухолевой трансформации клеток не происходит благодаря функционированию системы репарации ДНК, устраняющей поврежденные участки нуклеотидов. Факторы, снижающие активность системы репарации ДНК, облегчают развитие индуцированных или спонтанных мутаций, в том числе и опухолевой, что способствует опухолевой трансформации клеток. Многие канцерогены действительно вызывают одновременно и повреждение нуклеиновых кислот (т.е. мутации), и снижение репарации ДНК.
7. Теория недостаточности иммунологического надзора за нормальным антигенным составом внутренней среды организма (Ф. Бернет). Согласно этой теории в организме постоянно происходят спонтанные мутации, в результате чего образуются мутантные клетки, включая опухолевые, содержащие в своем составе антигены, несущие на себе признаки генетически чужеродной информации. Клетки с такими антигенами подлежат уничтожению эффекторными механизмами иммунной системы. В условиях иммунодепрессии такие спонтанно возникшие опухолевые клетки уничтожению не подвергаются и продолжают размножаться с образованием опухоли. Угнетение активности иммунной системы (иммунодепрессия) может быть вызвано самыми различными факторами, в том числе и канцерогенными. Таким образом, канцерогенные агенты способствуют развитию опухолевого роста, выступая одновременно в двух ипостасях - как этиологические факторы и как факторы условия канцерогенеза.
8. Теория двухстадийного канцерогенеза (И. Беренблюм). Согласно этой теории в канцерогенезе выделяют две стадии:
а) индукция – состояние, наиболее вероятно связано с мутацией, что приводит к образованию латентной, дремлющей опухолевой клетки;
б) промоции – активация и размножение ранее латентной опухолевой клетки с исходом в образование опухоли.
9. Теория онкогенов вирусной и иной природы (Д. Балтимор, М. Бардацид). В семидесятые годы было установлено, что геном ретровируса (например, вируса Рауса) состоит из 4-х генов (клеточный геном человека включает в себя 35-45 тысяч генов). Каждый ген кодирует синтез определенных белков. Один из этих четырех вирусных генов оказался онкогеном, кодирующим синтез «саркомного» онкобелка, вызывающего трансформацию нормальной клетки в опухолевую (src-онкоген). На обоих концах генома ретровируса находятся участки нуклеиновой кислоты, которые повышают активность соседних генов. На хромосомах человека установлена локализация более 40 онкогенов и примерно около 100 протоонкогенов.
Если изъять из вируса Рауса src-онкоген, то вирус теряет способность индуцировать опухолевый рост как in vivo, так и in vitro, т.е. и в клеточной культуре, и при прямом его введении в клетки. В то же время клонированный src-ген сам по себе вызывает опухолевую трансформацию при прямом его введении в нормальную клетку методом микроинъекций. Аналогично геному вируса Рауса построены геномы остальных онкогенных ретровирусов. К настоящему времени обнаружены около 30 онкогенов у 20 изученных онкорнавирусов. Все вирусные онкогены принято сокращенно обозначать тремя буквами: например, V-src (V – вирус, src – саркома Рауса).
В эти же годы было установлено, что ДНК соматических клеток млекопитающих содержит участки, гомологичные (близкородственные) по нуклеотидному составу онкогену вируса саркомы Рауса – scr. Вскоре обнаружилось, что для каждого из 20 известных ретровирусных онкогенов (онкорнавирусных генов) в геноме нормальных и опухолевых клеток разных видов животных имеется свой клеточный аналог. В нормальных клетках аналог вирусного онкогена неактивен. Он был назван протоонкогеном, в отличие от опухолевой клетки, где он активен, и поэтому называется активным клеточным онкогеном, или просто клеточным онкогеном. Клеточные онкогены, по аналогии с вирусными онкогенами, обозначаются четырьмя буквами латинского алфавита, только вместо первой буквы «V» пишется буква «C» (от слова «cellular» – клеточный). Например, клеточный онкоген саркомы Рауса, по аналогии с ее вирусным онкогеном V-src, обозначается C-src. Онкогены обнаружены практически у всех эукариот – от протозоа до человека. Дополнительно в опухолях обнаружен ряд клеточных онкогенов, которые не найдены в вирусах. Например, в клетках остеосаркомы человека, трансформированной in vitro химическим канцерогеном, есть клеточный онкоген Met. Истинно клеточные онкогены, обнаруженные в опухолях, программируют их неопластическую трансформацию при введении их в клеточную культуру.
Источниками клеточных онкогенов являются клеточные протоонкогены – предшественники онкогенов. Считается также, что клеточные онкогены и их предшественники не происходят из вирусных онкогенов. Скорее, вирусные онкогены возникли из клеточных онкогенов. Так, мутантные вирусы, потерявшие свои онкогены, сохраняют способность к размножению. Следовательно, «потерявшийся» онкоген не является жизненно необходимым для онкорнавирусов. В то же время экспериментальное «изъятие» клеточных онкогенов у некоторых многоклеточных приводит к их гибели (например, разрушение ras-1 или ras-2 у дрожжевых клеток). Далее, мутантный вирус Рауса, лишенный онкогена src, вновь его «захватывает» при пассировании этих вирусов через клетки саркомы Рауса, содержащие его. Наконец, существуют клеточные онкогены, не имеющие вирусных аналогов, например, онкоген с-Met в опухоли, индуцированной химическим канцерогеном.
Таким образом, онкогены в онкорнавируса не являются исходно присущими вирусам, а «украдены» ими из генома тех клеток, в которых они побывали. Есть основания полагать, что клеточные протоонкогены, из которых непосредственно образуются клеточные онкогены, представляют собой нормальные гены, программирующие деление и созревание клеток в период эмбрионального развития плода человека. При изменении их структуры или активности под влиянием канцерогенов они превращаются в активные клеточные онкогены, вызывающие опухолевую трансформацию клеток.
