Большинство клеток человека имеет одно ядро, однако имеются двухъядерные (например, некоторые нейроны, клетки печени, кардиомиоциты). Двух- и многоядерность являются результатом эндомитоза. Иногда многоядерными клетками называют структуры, которые образовались не вследствие эндорепродукции исходной клетки, а в результате слияния нескольких одноядерных клеток. Такие структуры имеют специальное название – симпласты; они встречаются, в частности, в составе скелетных поперечнополосатых мышечных волокон.
У эукариот хромосомы сосредоточены внутри ядра и отделены от цитоплазмы ядерной оболочкой, или кариотекой. Кариотека образуется за счет расширения и слияния друг с другом цистерн эндоплазматической сети. Поэтому кариотека образована двумя мембранами – внутренней и наружной. Пространство между ними называют перинуклеарным пространством. Оно имеет ширину 20 – 50 нм и сохраняет сообщение с полостями эндоплазматической сети. Со стороны цитоплазмы наружная мембрана нередко покрыта рибосомами.
Местами внутренняя и наружная мембраны кариотеки сливаются, а в месте слияния образуется пора. Пора не зияет: между ее краями упорядоченно располагаются белковые молекулы, так что в целом формируется поровый комплекс.
Комплекс поры представляет собой сложную структуру, которая состоит из двух рядов связанных между собой белковых гранул, каждая из которых содержит по 8 гранул, располагающихся на равном расстоянии друг от друга по обе стороны ядерной оболочки.
Через поровые комплексы осуществляется избирательный транспорт молекул и частиц из ядра в цитоплазму и обратно. Поры могут занимать до 25% поверхности ядра. Количество пор у одного ядра достигает 3000 – 4000, а их плотность составляет около 11 на 1 мкм2 ядерной оболочки. Из ядра в цитоплазму транспортируются, в основном, разные виды РНК. Из цитоплазмы в ядро поступают все ферменты, необходимые для синтеза РНК, для регуляции интенсивности этих синтезов и, в ряде клеток, молекулы гормонов, которые тоже регулирует активность синтезов РНК.
Внутренняя поверхность кариотеки связана с многочисленными промежуточными филаментами. В совокупности они образуют здесь тонкую пластинку, называемую ядерной ламиной. К ней прикреплены хромосомы. Ядерная пластинка связана с поровыми комплексами и играет главную роль в поддержании формы ядра. Она построена из промежуточных филаментов особой структуры. Нуклеоплазма содержит ионы, белки-ферменты, свободные нуклеотиды, АТФ, т.е. все необходимые вещества для ауто- и гетеросинтеза. Следовательно, кариоплазма, в целом, обеспечивает нормальное функционирование наследственного материала.
После фиксации и обработки тканей для световой или электронной микроскопии в кариоплазме становятся видными два типа хроматина (от греч. сhroma – краска): хорошо окрашивающийся электронно-плотный гетерохроматин, образованный осмиофильными гранулами размером 10-15 нм и фибриллярными структурами толщиной около 5 нм, и светлый эухроматин.
Гетерохроматин расположен в основном вблизи внутренней ядерной мембраны, контактируя с ядерной пластинкой и оставляя свободные поры, и вокруг ядрышка. Эухроматин находится между скоплениями гетерохроматина. По сути дела, хроматин – это комплексы веществ, которыми образованы хромосомы – ДНК, белок и РНК в соотношении 1: 1,3: 2. Основа каждой хромосомы образована ДНК, молекула которой имеет вид спирали. Она упакована различными белками, среди которых различают гистоновые и негистоновые. В результате ассоциации ДНК с белками образуются дезоксинуклеопротеиды (ДНП). В хромосоме молекула ДНК упакована компактно. Длина одной хромосомы человека в растянутом виде около 5 см, длина всех хромосом около 170 см.
ДНК ассоциирована с белками-гистонами, в результате чего образуются нуклеосомы, являющиеся структурными единицами хроматина. Нуклеосомы, напоминающие бусины диаметром 10 нм, состоят из 8 молекул гистонов (по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4), вокруг которых закручен участок ДНК, включающий 146 пар нуклеотидов. Между нуклеосомами располагаются линкерные участки ДНК, состоящие из 60 пар нуклеотидов, а гистон – HI обеспечивает взаимный контакт соседних нуклеосом. Нуклеосомы – это лишь первый уровень укладки ДНК. В результате суперспирализации ДНП в делящемся ядре хромосомы становятся видимыми при увеличении светового микроскопа.Каждая хромосома образована одной длинной молекулой ДНП.Они представляют собой удлиненные палочковидные структуры, имеющие два плеча, разделенные пентромерой. В зависимости от ее расположения и взаимного расположения плеч выделяют три типа хромосом: метацентрические, имеющие примерно одинаковые плечи; акроцентрические, имеющие одно очень короткое и одно длинное плечо; субметацентрические, у которых одно длинное и одно более короткое плечо. Некоторые акроцентрические хромосомы имеют спутников (сателлитов) – мелкие участки короткого плеча, соединенные с ним тонким неокрашивающимся фрагментом (вторичная перетяжка). В хромосоме имеются эу- и гетерохроматиновые участки. Последние в неделящемся ядре (вне митоза) остаются компактными. Чередование эу- и гетерохроматиновых участков используют для идентификации хромосом.
Метафазная хромосома состоит из двух соединенных центромерой сестринских хроматид, каждая из которых содержит одну молекулу ДНП, уложенную в виде суперспирали. При спирализации участки эу- и гетерохроматина укладываются закономерным образом, так что по протяжению хроматид образуются чередующиеся поперечные полосы. Их выявляют при помощи специальных окрасок. Поверхность хромосом покрыта различными молекулами, главным образом, рибонуклеопротеинами (РНП). В соматических клетках имеются по две копии каждой хромосомы, их называют гомологичными. Они одинаковы по длине, форме, строению, расположению полос, несут одни и те же гены, которые локализованы одинаково. Гомологичные хромосомы могут различаться аллелями генов, содержащихся в них. Ген – это участок молекулы. ДНК, на котором синтезируется активная молекула РНК. Гены, входящие в состав хромосом человека, могут содержать до двух миллионов пар нуклеотидов.
Итак, хромосомы представляют собой двойные цепи ДНК, окруженные сложной системой белков.С одними участками ДНК связаны гистоны. Они могут прикрывать их или освобождать. В первом случае данная область хромосомы не способна синтезировать РНК, во втором же синтез происходит. Это – один из способов регуляции функциональной активности клетки путем дерепрессии и репрессии генов. Существуют и иные способы такого управления.
Некоторые участки хромосом остаются окруженными белками постоянно и в данной клетке никогда не участвуют в синтезе РНК. Их можно назвать блокированными. Механизмы блокирования разнообразны. Обычно такие участки очень сильно спирализуются и покрываются не только гистонами, но и другими белками с более крупными молекулами.
Деспирализованные активные участки хромосом не видны под микроскопом. Лишь слабая гомогенная базофилия нуклеоплазмы указывает на присутствие ДНК; их можно выявить также гистохимическими методами. Такие участки относят к эухроматину. Неактивные сильно спирализованные комплексы ДНК и высокомолекулярных белков выделяются при окрасках в виде глыбок гетерохроматина. Хромосомы фиксированы на внутренней поверхности кариотеки к ядерной ламине.
Следует отметить, что между интерфазными ядрами клеток, взятых от особей мужского и женского пола существует различие, позволяющее определить пол индивидуума, которому принадлежали клетки. В ядрах женских клеток обнаруживается глыбка хроматина около 1 мкм в диаметре, лежащая почти всегда на внутренней поверхности ядерной оболочки. Природа этой хроматиновой глыбки (тельце Барра) установлена – это одна из 2-х Х-хромосом, остающаяся в интерфазе в конденсированном состоянии. В ядрах клеток мужского пола (в N) таких глыбок полового хроматина не обнаруживается. Но если мужская клетка содержит две Х-хромосомы, как при синдроме Клайнфельтера, то обнаружится тельце Барра. Соответственно, если в женских клетках Х-хромосом не две, а три, как при трисомии, то телец Барра будет два. Метод определения полового хроматина используется при диагностике половых генетических аномалий.
Морфологию митотических хромосом лучше всего изучать в стадии метафазной пластинки, т.е. в момент наибольшей конденсации. У каждой хромосомы имеется первичная перетяжка, которая делит хромосому на 2 плеча. В зависимости от положения центромеры, хромосомы бывают равноплечими (метацентрическими) и неравноплечими (субметацентрическими и акроцентрическими). Некоторые хромосомы кроме первичной перетяжки имеют вторичную, которая является местом формирования ядрышек.
Совокупность числа, величины и морфологии хромосом соматических клеток называется кариотипом вида. Кариотип – это генетический критерий вида («лицо вида»). Для каждого вида характерно (в N) строго определенное количество хромосом (правило постоянства). В практику хромосомного анализа широко входят методы дифференциального окрашивания хромосом. При обработке хромосом специальными красителями во флуоресцентном микроскопе видна исчерченность по длине хромосом (провел впервые Касперссон в 1968г, обрабатывал акрихин-ипритом, ныне есть и другие методы). Каждая пара хромосом характеризуется индивидуальной исчерченностью (равно как отпечаток пальцев). Идентификация хромосом позволяет составить идиограмму кариотипа.
На основании ряда критериев 22 пары хромосом человека классифицированы, половые хромосомы 23-й пары выделяются отдельно (Международная Денверская классификация, 1960г). Для идентификации применяют морфометрический метод и центромерный индекс.
Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека была выработана на международных совещаниях, созывавшихся в Денвере (1960г), Лондоне(1963г) и Чикаго (1966г). Согласно рекомендациям этих конференций, хромосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все хромосомы разделены на семь групп, которые были обозначены буквами английского алфавита от А до G. Все пары хромосом было предложено нумеровать арабскими цифрами.
Группа А (1-3) – самые крупные хромосомы. Хромосомы 1 и 3 – метацентрические, 2 – субметацентрическая.
Группа В (4-5) – две пары крупных субметацентрических хромосом.
Группа С (6-12) – хромосомы субметацентрические, средних размеров. Х-хромосома по размеру и морфологии сходна с хромосомами 6 и 7.
Группа D (13-15) – акроцентрические хромосомы средних размеров.
Группа Е (16-18) – средние хромосомы (16, 17 – метацентрические, 18 – акроцентрическая).
Группа F (19-20) – мелкие метацентрики, практически между собой не различимы.
Группа G (21-22) – две пары самых мелких акроцентрических хромосом. Y-хромосома выделяется как самостоятельная, но по морфологии и размерам она относится к группе G.
При этом хромосомы различных групп хорошо отличаются друг от друга, в то время как внутри группы их невозможно различить, за исключением группы А. Каждая хромосома человека содержит только ей свойственную последовательность полос, что позволяет точно идентифицировать каждую хромосому и с более высокой точностью определить, в каком сегменте произошла перестройка. Поперечная исчерченность хромосом есть результат неравномерной конденсации гетеро- (высокоспирализованная ДНК) и эухроматина (релаксированная ДНК) на протяжении всей длины хромосомы, отражающий порядок расположения генов в молекуле ДНК.
Кариотип человека в норме и при отклонениях обозначается таким образом:
46, XY – нормальный кариотип мужчины
46, XX – нормальный кариотип женщины
47, XX+G – кариотип женщины с лишней хромосомой из группы G
В настоящее время существует ДНК-маркеры (или зонды) для многих еще более мелких сегментов практически всех пар хромосом. С помощью таких ДНК-зондов можно точно оценить наличие или отсутствие определенного, даже очень маленького, сегмента в хромосоме.
Возможность идентификации хромосом позволяет выявлять хромосомные аномалии, как на уровне соматических клеток, так и первичных половых клеток. Эти аномалии возникают в трех случаях на 100 беременностей. Аномалии по крупным хромосомам не совместимы с жизнью и вызывают самопроизвольные выкидыши на разных сроках. Широко известна болезнь Дауна, когда в кариотипе присутствует лишняя 21-ая хромосома: 2n+1(+21). Частота рождаемости детей с трисомией по 21-ой хромосоме высокая 1:500 и продолжает расти в связи с неблагоприятным экологическим окружением, приводящем к нерасхождению 21 пары хромосом.
Как было упомянуто выше, во вторичных перетяжках некоторых хромосом осуществляется образование ядрышек, но независимо от количества, их общая масса ядрышкового материала оказывается при этом постоянной. В клетках быстро пролиферирующих злокачественных новообразований ядрышки обычно крупнее, что сопряжено с активным синтезом белка. Ядрышко служит местом синтеза рибосомной РНК вдоль молекул ДНК деконденсированного хроматина в пределах ядрышкового материала. В связи с этим, области хромосом, выполняющие эту функцию, называют организаторами ядрышка. У человека это 13, 14, 15, 21, 22 хромосомы, имеющие сателлиты (спутники). Образующиеся в результате транскрипции ядрышки в разных ядрышковых организаторах, затем сливаются в общую единую структуру, поэтому, чаще всего в ядре одно ядрышко. По данным ЭМ, ядрышко представляет собой структуру, состоящую из участков темного и светлого материала, не окруженных мембраной. Зернистость темной части обусловлена скоплением рибонуклеопротеидных частиц (гранулярная часть ядрышка). Другой компонент темной части – фибриллярный, представлен плотными тонкими нитями р-РНК, а их скопления называют фибриллярными центрами. Светлые участки – это компоненты ядерного сока. Ядрышко в конце профазы исчезает, хроматин его конденсируется, фибриллярный и гранулярный материал деконденсируется, с середины телофазы процессы идут в обратном порядке. Таким образом, единственный компонент ядрышка, сохраняющий какую-то непрерывность от одного поколения клеток до следующего, это хроматин, содержащий ДНК, которая кодирует р-РНК – организаторов ядрышек. Схема участия ядрышек в синтезе цитоплазматических белков представлена следующим образом: на ДНК вторичных перетяжек хромосом образуется р-РНК, которая в зоне ядрышка образует комплексы с белком – субъединицы рибосом, которые через ядерную оболочку выходят в цитоплазму и участвуют в процессах синтеза белка. Соответственно, ядерная оболочка для этого должна быть структурно, а значит и функционально состоятельной.
Кариотека (оболочка ядра) характерна для всех эукариотических клеток, состоит из 2-х мембран – внешней и внутренней с перинуклеарным пространством между ними шириной 20-60 нм. Мембраны ядерной оболочки в морфологическом отношении не отличаются от остальных внутриклеточных мембран. Ее особенность заключается в том, что в зонах многочисленных слияний 2-х мембран образуются округлые перфорации – поровые комплексы. Каждое округлое отверстие заполнено сложноорганизованными глобулярными и фибриллярными структурами октагональной симметрии: три ряда гранул по 8 штук в каждом, размером 25 нм. Один ряд располагается со стороны цитоплазмы, другой со стороны ядра и третий между ними. В центре всей структуры располагается центральная гранула. Все гранулы соединены фибриллами, которые поперек поры образуют перегородку-диафрагму. Размеры пор стабильны, число же подвержено значительным вариациям, что связано с функциональной активностью клеток и размерами ядра: чем выше синтетические процессы в клетках, тем больше пор на 1 мкм. (в зрелых сперматозоидах их нет). По поверхности ядра поры располагаются, как правило, равномерно, но число их резко падает в тех местах ядерной оболочки, где фиксируется гетерохроматин. Поровые комплексы обнаружены в мембранах гранулярного эндоплазматического ретикулума. Внешняя мембрана ядерной оболочки, непосредственно контактирующая с цитоплазмой клетки, имеет неровную поверхность, переходит в систему каналов эндоплазматической мембраны и также содержит на своей поверхности рибосомы.
При делении клеток ядерная оболочка фрагментируется и микротрубочками веретена деления оттесняются (ее отдельные элементы) к периферическим зонам. При реконструкции новых ядер идет сборка мембран ядра из мембран ЭПС, а сигналом, по-видимому, служит деконденсация хромосом. Ядерная оболочка проницаема для веществ малого молекулярного веса-моносахаридов, аминокислот, нуклеотидов, ферментов для ауто- и гетеросинтеза. Через нее в ядро проходят гистоновые и негистоновые белки для образования хромосом.
Из ядра в цитоплазму транспортируются рибосомы, РНК. Еще один путь транспорта связан с образованием выростов ядерной оболочки, которые могут отделяться от ядра в виде вакуолей, содержимое их затем изливается в цитоплазму.
