Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


Ёлектрические свойства белков




Ѕелки €вл€ютс€ амфотерными полиэлектролитами (полиамфолитами), при этом группами, способными к ионизации в растворе, €вл€ютс€ карбоксильные остатки боковых цепей кислых аминокислот (аспарагинова€ и глутаминова€ кислоты) и азотсодержащие группы боковых цепей основных аминокислот (в первую очередь ε-аминогруппа лизина и амидиновый остаток CNH(NH2) аргинина, в несколько меньшей степени Ч имидазольный остаток гистидина). Ѕелки как полиамфолиты характеризуютс€ изоэлектрической точкой (pI) Ч кислотностью среды pH, при которой молекулы данного белка не несут электрического зар€да и, соответственно, не перемещаютс€ в электрическом поле (например, при электрофорезе). ¬еличина pI определ€етс€ отношением кислотных и основных аминокислотных остатков в белке: увеличение количества остатков основных аминокислот в данном белке ведЄт к увеличению pI; увеличение количества остатков кислых аминокислот приводит к снижению значени€ pI.

«начение изоэлектрической точки €вл€етс€ характерной константой белков. Ѕелки с pI меньше 7 называютс€ кислотными, а белки с pI больше 7 Ч основными. ¬ целом, pI белка зависит от выполн€емой им функции: изоэлектрическа€ точка большинства белков тканей позвоночных лежит в пределах от 5,5 до 7,0, однако в некоторых случа€х значени€ лежат в экстремальных област€х: так, например, дл€ пепсина Ч протеолитического фермента сильнокислого желудочного сока pI ~ 1[9], а дл€ сальмина Ч белка-протамина молок лосос€, особенностью которого €вл€етс€ чрезвычайно высокое содержание аргинина, pI ~ 12. Ѕелки, св€зывающиес€ с нуклеиновыми кислотами за счЄт электростатического взаимодействи€ с фосфатными остатками нуклеиновых кислот, часто €вл€ютс€ основными белками. ѕримером таких белков служат гистоны и протамины.

 

 оличественные методы определени€ белка.

 ак при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержани€ белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце.  роме того, анализ содержани€ белков в биологических жидкост€х (крови) имеет важное биомедицинское значение и используетс€ в диагностических цел€х.  оличественное определение белка проводитс€, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции.

Ќаиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определени€ белка.

Ѕ»”–≈“ќ¬џ… ћ≈“ќƒ

ѕринцип метода. ћетод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. ƒл€ биуретовой реакции необходимо наличие двух ќЌ-групп и трех атомов азота, наход€щихс€ в полипептидной цепи. √руппа, образующа€ пептидную св€зь (Ц ќ— Ц NH Ц) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. ¬ избытке щелочи происходит диссоциаци€ водорода енольной ќЌ-группы, при этом возникает отрицательный зар€д, с помощью которого кислород, взаимодейству€ с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) св€зи с атомами азота пептидных св€зей. ¬озникший комплекс характеризуетс€ высокой стабильностью.

„увствительность данного метода позвол€ет определ€ть белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

 

‘отоэлектроколориметр.

‘отоэлектроколориметр (‘Ё ) вошел в лабораторную практику настолько широко, что больша€ часть анализов заканчиваетс€ при помощи этого прибора. ѕринцип действи€ прибора базируетс€ на основном законе колориметрии, который характеризуетс€ пр€молинейной зависимостью между концентрацией окрашенного раствора и его оптической плотностью. ћетод измерени€ относитс€ к объективным, независимым от глаза человека. »ндивидуальные ошибки сведены к минимуму. Ќаиболее распространенными фотоколориметрами в нашей стране €вл€ютс€ ‘Ё -56 (‘Ё -56ћ). ¬ них имеютс€ два вакуумных фотоэлемента, токи которых направлены навстречу друг другу по дифференциальной схеме. ѕри равенстве интенсивности левого и правого световых потоков стрелка микроамперметра устанавливаетс€ на нуле.

–анее примен€вшийс€ нулевой прибор (индикаторна€ лампа) себ€ не оправдал и был заменен стрелочными микроамперметрами. Ћевый и правый барабан ‘Ё а независимы, и каждый из них управл€ет своей диафрагмой. ѕор€док работы на ‘Ё -56. ѕри первом способе устанавливают электрический нуль при закрытой шторке (световые потоки перекрыты), при этом стрелку микроамперметра устанавливают на нуле. ¬ левый кюветодержатель помещают кювету с нулевым раствором (или контрольным раствором), в правый Ч кювету с опытным (анализируемым) раствором. ѕравый барабан устанавливают на нуль оптической шкалы (100 по пропусканию). ¬ращением левого барабана добиваютс€ установки стрелки микроамперметра на нуль. «атем в правый кюветодержатель ввод€т кювету с нулевым раствором. »нтенсивность правого светового потока возрастает и стрелка микроамперметра отклон€етс€. ¬ращением правого барабана уменьшают интенсивность светового потока, пока оба потока не сравн€ютс€ (стрелка на нуле). ќтсчет производ€т по правому барабану.  ак можно заметить, при описанном способе измерени€ дл€ каждого замера опытной пробы необходимо заново уравнивать световые потоки по нулевому раствору. ѕри большом числе однотипных анализов это замедл€ет работу. Ќа практике оправдал себ€ другой пор€док измерени€, ускор€ющий работу примерно в 2 раза. ѕри этом способе уравнивание светового потока с контролем производитс€ один раз на серию из 10Ч15 определений, после чего снова провер€ют контроль и продолжают измерени€. ¬торой способ измерени€ состоит в следующем. ѕосле прогрева ‘Ё а в правый и левый пучок света помещают кюветы с контрольным раствором. »ндекс правого барабана став€т на нуль экстинкции (100% по пропусканию). ¬ращением левого барабана стрелка прибора устанавливаетс€ на нулевое деление. «атем в левый пучок света вместо кюветы с контролем ввод€т такую же кювету с опытной пробой. —трелка прибора отклон€етс€ от нул€. ¬ращением правого барабана (от себ€) стрелку микроамперметра устанавливают на нуль (при неизменном положении левого барабана). ќтсчет ведут по правому барабану. ¬ дальнейшем опытную пробу в левом кюветодержателе мен€ют на следующую и снова уравнивают фототок вращением правого барабана. —нимают отсчет и т. д. (левый барабан остаетс€ неподвижным). ƒл€ получени€ правильных результатов при фотоколориметрии большое значение имеет чистота кювет. ѕереставл€€ кюветы, их следует брать пальцами только за боковые грани, через которые не проходит световой поток. ƒл€ исследовани€ биологических веществ примен€ютс€ специально очищенные реактивы и вода. ћежду тем при проведении контрольного опыта, когда проделываютс€ все операции с реактивами (только без биологического материала), обычно обнаруживаетс€ окраска, определ€ема€ как искомое вещество (но в меньшем количестве). Ёту поправку на контрольную пробу нужно вычесть из результата анализа. ¬ этом

и заключаетс€ смысл пон€ти€ Ђпротив контрол€ї. ¬ычитание контрол€ может быть выполнено двум€ способами: а) арифметическим вычитанием экстинкции контрол€ (или его вычисленного значени€). ¬ ‘Ё е в оба кюветодержател€ став€т кюветы с чистой водой и уравнивают фототоки. «атем замен€ют воду контрольной пробой. »змер€ют экстинкцию контрол€. “ак же измер€етс€ опытна€ проба. ѕолученна€ экстинкци€ контрол€ вычитаетс€ из экстинкции опыта (измерени€ провод€тс€ на фоне воды); б) автоматическим вычитанием. ¬ оба световых потока став€т кюветы с контрольной пробой, и после уравнивани€ фототоков в измерительной стороне замен€ют контрольную пробу на опытную. ¬ этом случае измерение опытной пробы происходит на фоне контрол€, который автоматически вычитаетс€ в процессе измерени€. ¬еличина контрол€ остаетс€ неизвестной. ќсновной закон фотометрии предполагает, что в определенных услови€х график зависимости между концентрацией окрашенного раствора и его экстинкцией (оптической плотностью) выражаетс€ пр€мой линией. Ќа практике, однако, наблюдаютс€ отклонени€, вызванные деформацией молекул, недостаточной монохроматичностью света, изменением степени диссоциации ионов и другими причинами. „аще отклонени€ бывают с уменьшением пропорциональности, когда равномерное увеличение концентрации вещества сопровождаетс€ все меньшим приростом экстинкции, отсюда и название Ђкалибровочна€ крива€ї. ¬ зависимости от свойств конкретного вещества, стабильности его окрашенного раствора, воспроизводимости данных примен€ют тот или иной способ калибровки и дальнейшего его определени€. ќбычно это указываетс€ в описании метода. ≈сли в выбранном диапазоне концентраций сохран€етс€ пр€ма€ пропорциональность с экстинкцией при хорошей воспроизводимости, то в этом случае можно вести расчет результатов анализа как по калибровочному графику, так и с помощью вычисленного коэффициента. ≈сли график аналогичен линии 2, то расчет можно вести только по калибровочному графику, поскольку нет посто€нного коэффициента на всем прот€жении графика. ќсновным требованием к такому графику €вл€етс€ хороша€ воспроизводимость и стабильность при его повторном построении. ¬о всех случа€х работы с калибровочным графиком его надо периодически провер€ть. ѕериодичность проверки устанавливаетс€ опытным путем. ¬ среднем это можно делать раз в 3 мес. или реже. Ќередко на интенсивность окраски исследуемого вещества вли€ет качество одного из примен€емых реактивов. —ледовательно, при замене этого реактива следует проверить калибровочный график. “о же нужно делать при замене осветительной лампы фотоколориметра или после его ремонта. ѕроверку не об€зательно проводить в полном объеме. ƒостаточно бывает проверить 2 Ч 3 точки. ѕри совпадении найденных результатов с прежними, график остаетс€ в силе. “ак же поступают при работе с коэффициентом. —уществуют вещества, чрезвычайно чувствительные к малейшим отклонени€м в процессе проведени€ анализа (например, к услови€м кип€чени€ и др.). ≈сли вз€ть две одинаковые пробы и обработать их отдельно, то можно получить неодинаковую окраску (экстинкцию). ¬ таких случа€х опытна€ и стандартна€

пробы должны обрабатыватьс€ вместе (одновременно), чтобы услови€ проведени€ реакции были одинаковыми. –асчет ведут по отношению к стандарту. ѕри этом результат тем точнее, чем ближе концентрации опытных и стандартных проб.

 

ѕрицип метода диализа.

ƒиализ - искусственное очищение крови и других жидкостей человеческого тела от скопившихс€ шлаков, когда органы самого человека неспособны нормально выполн€ть эти функции. ќбычно кровь фильтруетс€ в почках, которые задерживают полезные вещества, а вредные выдел€ют с мочой. ѕри заболевани€х почек, когда одна или обе почки не функционируют, больному необходим диализ. —уществуют два метода диализа. ѕервый - очищение крови через брюшину (перитониальный) в самом теле, второй - подключение к искусственной почке.

ѕринцип действи€ диализа

ѕринцип действи€ диализа основан на законах осмоса. ƒл€ того, чтобы эти законы действовали, необходимы очень тоненькие мембраны, проницаемые только дл€ воды и определенных веществ, растворенных в ней.  огда с обеих сторон этих мембран образуетс€ различна€ концентраци€ жидкости, тогда эти жидкости пытаютс€ проникнуть сквозь мембрану, чтобы выровн€ть уровень концентрации и установить равновесие: если с одной стороны мембраны каких-либо веществ больше, чем с другой, часть их попадает на другую сторону. ≈стественные мембраны человеческого тела - это легкие, брюшина и капилл€ры почек; эти мембраны пропускают определенные вещества, а другие составные части крови в ней и остаютс€. “очно таков механизм действи€ диализа, который назначаетс€ при нарушении функции почек или отравлени€х (грибами, лекарствами). —уществует много людей, которым диализ повтор€ют несколько раз в неделю. ѕри т€желых заболевани€х почек гемодиализ (искусственна€ почка) еще может обеспечить почти нормальную жизнь, однако известно, что лучшее решение - это пересадка почки (трансплантаци€).

 

 

 лассификаци€ белков.

¬ насто€щее врем€ еще не разработана стройна€ система номенклатуры и классификации белков. “радиционна€ классификаци€ белков по группам, основанна€, скорее, на случайных показател€х (физико-химические свойства, форма молекул, локализаци€ и происхождение, аминокислотный состав), уже не отвечает полностью возросшему уровню знаний о их структуре и функци€х. »з огромного количества природных белков структура и функции расшифрованы дл€ относительно небольшого числа (не более нескольких сотен), и поэтому структура и функции белков пока не могут служить основой дл€ их рациональной классификации. ѕожалуй, только дл€ одной группы белков, обладающих способностью катализировать химические реакции, т.е. ферментов, разработана стройна€ система номенклатуры и классификации, в основу которой положены типы катализируемых химических реакций и химическа€ природа реагирующих веществ. ќднако полностью идентифицированные до сих пор ферменты также составл€ют незначительную долю белков (ферментов описано более 3000). “ем не менее функциональный принцип, рекомендуемый некоторыми авторами, хот€ и не может служить универсальной основой дл€ классификации всех белков, представл€ет определенный интерес. ¬ соответствии с функциональным принципом различают 12 главных классов белков: 1) каталитически активные белки (ферменты); 2) белки-гормоны (хот€ есть и стероидные гормоны); 3) белки-регул€торы активности генома; 4) защитные белки (антитела, белки свертывающей и антисвертывающей систем крови); 5) токсические белки; 6) транспортные белки; 7) мембранные белки; 8) сократительные белки; 9) рецепторные белки; 10) белки-ингибиторы ферментов; 11) белки вирусной оболочки; 12) белки с иными функци€ми.

Ѕыли предприн€ты также попытки классифицировать белки, исход€ из особенностей вторичной и третичной структуры. ¬ соответствии с этим различают α-, β-, α+β- и α/β-белки. α-Ѕелки содержат только α-спирали (не менее 60%), β-белки Ц только β-структуры (не менее двух антипараллельных цепей), α+β-белки Ц те и другие структуры в пределах одной полипептидной цепи (пример Ц молекулы лизоцима), а класс α/β-белков содержит множество α- и β-структур, чередующихс€ вдоль полипептидной цепи или домена (см. рис. 1.19). ƒомены создаютс€ объединением и чередованием α-спиралей и β-слоев, между которыми открываютс€ более рыхлые структуры.

”читыва€ необходимость дл€ студента-медика основательного знакомства с отдельными группами белков, которые могут служить предметом изучени€ в его будущей профессиональной де€тельности (например, белки крови), приводим старую классификацию белков с краткой характеристикой новых данных о структуре, составе и свойствах отдельных представителей. —огласно этой классификации, обширный класс белковых веществ в зависимости от химического состава дел€т на простые и сложные белки.

ѕростые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаютс€ соответственно только на свободные аминокислоты.

—ложные белки Ц это двухкомпонентные белки, которые состо€т из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого про-стетической группой. ѕри гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, освобождаетс€ небелкова€ часть или продукты ее распада.

ѕростые белки в свою очередь дел€тс€ на основании некоторых условно выбранных критериев на р€д подгрупп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и др.  лассификаци€ сложных белков (см. главу 2) основана на химической природе вход€щего в их состав небелкового компонента. ¬ соответствии с этим различают фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту), хромопротеины (в состав их вход€т пигменты), нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты), гликопротеины (содержат углеводы), липопротеины (содержат липиды) и металлопротеины (содержат металлы).

 





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-11-05; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 2312 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ќе будет большим злом, если студент впадет в заблуждение; если же ошибаютс€ великие умы, мир дорого оплачивает их ошибки. © Ќикола “есла
==> читать все изречени€...

1480 - | 1274 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.021 с.