А)Регуляция содержания РНК в процессе биосинтеза
Образование РНК у прокариот чаще всего регулируется на уровне инициации транскрипции несколькими способами. Первый заключается в модификации структуры РНК-полимеразы. Так, бета-(или бета-прим) субъед. РНК-полимеразы Е. coli изменяется при заражении клеток некоторыми бактериофагами. Другой пример- образование новой, сигма-субъед. при споруляции определенных штаммов Bacillus. И в том и другом случае изменяются способность РНК-полимеразы к связыванию с промотором и скорость транскрипции соотв-щих генов. Второй способ - изменение пространственной структуры ДНК, что влияет на способность РНК-полимераз связываться с определенными промоторами и инициировать синтез РНК. И наконец, взаимодействие РНК-полимеразы с некоторыми промоторами может ингибироваться или стимулироваться белками, которые связываются с ДНК в месте присоединения полимеразы или вблизи него. На связывание таких регуляторных белков - репрессоров и активаторов - часто влияют определенные метаболиты, играющие роль корепрессоров и коактиваторов.
Скорость элонгации РНК зависит также от вторичной структуры мРНК. Сигналы, которые определяют, дойдет ли транскрипция до конца или закончится преждевременно, играют ключ.роль в рег-ции уровня мРНК. В подобных случаях за прекращ-е или продолж-е транскрипции отвечают определ.нуклеотидные последов-ти и белки.
В)Согласованная регуляция экспрессии генов
Согласованная регуляция групп родственных генов. У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции, часто рег-ся соглас-но. Это значит, что их экспрессия нач-ся и заканч-ся или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскрибируются с промотора, находящегося на 5'-конце такой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным (или полигенным) транскриптом. Группа координированно экспрессирующихся генов называется опероном. Три гена, кодирующие ферменты, ответственные за метаболизм галактозы у Е. coli, организованы в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом-оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности: galE-galT-galK. Ген gal R, кодирующий репрессор gal -оперона, не сцеплен с опероном.
Гены, кодирующие несколько родственных функций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены, кодирующие 30S- и 50S-рибосомные белки, организованы во множественные опероны, в чей состав иногда входят гены, кодирующие другие белки, которые участвуют в транскрипции и/или трансляции
Позитивная и негативная регуляция. Негативная регуляция инициации транскрипции, или репрессия, осуществляется белками-репрессорами, которые связываются с операторами. Поскольку последовательности оператора и промотора часто перекрываются, связывание репрессоров со своими операторами ограничивает доступ РНК-полимеразы к промотору, подавляя тем самым инициацию транскрипции. Позитивная регуляция может осущ-ся путем связывания специфических белков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, следовательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.
Гены, кодирующие регуляторные белки, которые связываются с операторными или активаторными последовательностями, могут находиться как вблизи контролируемых ими генов, так и далеко от них. Например, ген, кодирующий репрессор галактозного оперона (galR), не сцеплен с транскрипционной единицей, состоящей из генов galE, galT и gal К. Напротив, позитивная или негативная регуляция транскрипции арабинозного оперона зависит от того, образуется или нет комплекс между арабинозой и белком, кодируемым только сцепленным с опероном геном ara C.
В) Регуляция экспрессии лактозного оперона
Негативная регуляция. Бактерии Е. coli могут использовать в кач-ве единств.источника углерода и энергии лактозу, поскольку они способны образовывать в большом количестве b-галактозидазу - фермент, расщепляющий лактозу на глюкозу и галактозу. Однако при росте на других источниках углерода в клетках Е. coli образуется очень мало b-галактозидазы. Ген, ответственный за синтез b-галактозидазы (lac Z), называется индуцибельным, поскольку кодируемый им фермент синтезируется только тогда, когда в клетке присутствуют сахара, имеющие b-галактозильные остатки. Помимо b-галактозидазы, b-галактозиды индуцируют образование еще двух белков: b-галактозидпермеазы (кодируемой геном lac Y), необходимой для проникновения b-галактозидов в клетку, и b-галактозидтрансацетилазы (1ас А), фермента с невыясненной пока функцией. В этих трех генах- lac Z, lacY и lac А - содержится вся информация о белках, кодируемых lac -опероном. Они транскрибируются в единую полицистронную РНК, при трансляции которой образуются почти одинаковые количества соответствующих белков.
Со структурными генами lac -оперона связаны несколько типов регуляторных элементов,. Промотор -это нуклеотидная последовательность, с которой связывается РНК-полимераза и начинается транскрипция трех структурных генов. Оператор -это сайт, с которым связывается lac -репрессор, подавляющий транскрипцию lac -оперона. Ген lac I, не входящий в состав lac -оперона, кодирует репрессор-полипептидную цепь с мол. массой 37000 Да. Репрессор прочно связывается с оператором, находясь в тетрамерной форме.
Поскольку промоторная и операторная последовательности перекрываются, связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНК-полимеразы с промотором, что приводит к блокир-ю транскрипции структурных генов. Транскрипцию оперона можно индуцировать, если блокировать связывание репрессора с оператором. Такое блокирование происходит при связывании одного из b-галактозидов с той или иной субъединицей репрессора, что уменьшает сродство последнего к оператору. После отсоединения репрессора от промотора полимераза может связаться с промотором и инициировать транскрипцию оперона.
Очень важно сохранение нуклеотидной последовательности домена lac -оператора, связывающего репрессор. Мутации, уменьшающие сродство репрессора к оператору, приводили к конститутивному синтезу ферментов, кодируемых lac -опероном, т. е. к экспрессии lac -ферментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопровождающиеся накоплением репрессора в клетках или увеличением сродства репрессора к оператору, делали lac -оперон неиндуцибельным.
Позитивная регуляци я. Для экспрессии lac -оперона, как и других индуцибельных оперонов,, необходимо не только снять репрессию оперона, но и получить некий сигнал. Таким сигналом служит комплекс циклического AMP (cAMP) с белком-активатором катаболизма (САР-catabolite activator protein), который связывается со специфической послед-тью, находящейся в самом начале lac -промотора. сАМР, образуется из АТР в ответ на самые разные вне-и внутрикл.события. САР представляет собой димер из идентичных полипептидных цепей с мол. массой 22 кДа. Связывание комплекса САР-сАМР со специфической последовательностью в начале промотора приводит к усилению транскрипции lac -оперона почти в 50 раз. Сам по себе САР не способен к такому связыванию и стимуляции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью комплекса САР-сАМР можно объяснить тем, что, связываясь с ДНК в непосредственной близости от сайта присоединения РНК-полимеразы, он усиливает сродство этого фермента к промотору. Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание САР-сАМР cСАР-сайтом предотвращает присоединение РНК-полимеразы к расположенному поблизости слабому промотору и увеличивает тем самым вероятность того, что полимераза свяжется с «правильным» промоторным сайтом.
Г). Временная регуляция генной экспрессии в жизненном цикле бактериофага l.
У бактериофага l есть два альтернативных способа существования. При литическом пути все вирусн.гены экспрессируются в определ.временной послед-ти, в рез-те чего образ.примерно сотня фаговых частиц и происходит лизис инфицированной бактерии. Интегрированная форма вирусн.генома называется профагом. В лизогенных клетках профаговая ДНК многократно реплицируется при помощи клеточн.ап-та так, как будто она является частью клеточного генома. При этом, однако, все фаговые гены, кроме одного, выключены.
Литический путь. Гены, кодирующие структурные белки (головки и хвосты), сконцентрированы в одной области ДНК; гены, кодирующие ферментативные (репликацию и рекомбинацию) и регуляторные (репрессию и антитерминацию) функции, сосредоточены в другой области генома.
После инфекции фаговая ДНК замыкается в кольцо путем соединения липких концов. Затем РНК-полимераза Е. coli транскрибирует те фаговые мРНК, которые кодируют белки, необходимые на самых ранних этапах жизненного цикла,- т.н.предранние мРНК. Одна из этих предранних мРНК транскрибируется справа налево с промотора PL, а терминатором служит последовательность tL1. На этой мРНК (L1) синтезируется регуляторный белок N, работающий как антитерминатор. Другая предранняя мРНК транскрибируется слева направо с промотора PR к терминатору tR1и кодирует только белок Сrо.
По мере накопления белка N происходит аттенуация(ослабление;регуляция транскрипции с помощью сигнала терминации транскрипции, расположенного между промотором и началом первого структурного гена)терминации в tL1и tR1, РНК-полимераза продолжает транскрипцию через эти сайты с образованием мРНК второго типа - задержанных ранних транскриптов. Более крупный транскрипт, начинающийся с промотора PL (L2), кодирует ферменты, участвующие в рекомбинации, и ферменты, катализирующие встраивание ДНК фага l в ДНК клетки-хозяина. Задержанный ранний транскрипт, начинающийся с промотора PR (R2), кодирует ферменты, ответственные за репликацию фаговой ДНК (белки О и Р), и еще один регуляторный белок Q. Белок Q вызывает аттенуацию терминации транскрипции в терминаторном сайте ( tR3 ), расположенном сразу за промотором P R'. При транскрипции с промотора P R' транскрибируются гены (S и R), ответственные за включение лизиса клеток. К.т., поскольку ДНК фага l, сразу после инфекции замыкается в кольцо, S - иR-гены оказываются рядом с генами, кодирующими белки головки и хвоста фага. След-но, в рез-те транскрипции, инициир-ной в PR и продолженной через tR3, образуется мРНК, кодирующая белки лизиса и все структурные вирусные белки. Итак, мы рассмотрели образование аппарата, необходимого для литич.инфекции: ферментов репликации вирусной ДНК и вирусных белков, участвующих в формировании зрелых фаговых частиц.
Лизогенный путь. Для того чтобы понять это, нужно усложнить схему строения промоторов РL, и PR и ввести несколько дополнительных генов, генных продуктов и промоторов. На самом деле PL и PR являются частью сложной регуляторной области, в которой промоторы перемежаются с операторными послед-тями OL и OR соответственно. OL и ОR -это сайты связывания двух регулягорных белков: репрессора сI и антирепрессора Сrо. Белок Cro-это продукт трансляции предранней мРНК, транскрибируемой вправо с промотора PR. Репрессор кодируется геном сI, локализованным между PR и PL /OL. сI-мРНК транскрибируется в направлении влево от промотора PRE, находящегося справа от Cro-гена. PRE сам активируется двумя «позитивными» регуляторными белками, cII и cIII, которые синтезируются после того, как благодаря действию белка N образуются транскрипты мРНК, инициированные в PR и PL, соответственно.
По мере накопления репрессора сI происходит его связывание с левым и правым операторными сайтами, в результате чего подавляется экспрессия всех генов, транскрибирующихся с PR и РL. В этом случае предпочтительным оказывается лизогенный путь, поскольку блокируется образование ферментов репликации и структурных вирусных белков, а небольшое количество интеграционного фермента Int, синтезированного с задержанной ранней мРНК, успевает катализировать рекомбинацию между фаговой и бактериальной ДНК до момента полной репрессии фаговых генов.
Д)Трансляционная регуляция экспрессии некоторых генных продуктов
Синтез белков, составляющих собственно аппарат трансляции, регулируется на уровне трансляции. Гены, кодирующие белки больших (L) и малых (S) субчастиц рибосомы и некоторых белков, участвующих в процессе трансляции (в том числе EF-Tu и EF-G), рассеяны по нескольким оперонам. Это позволяет координированно регулировать синтез тех генных продуктов, которые должны функционировать согласованно. Экспрессия таких генов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции происходит координированно. Как мы увидим далее, синтез рибосомных белков частично регулируется также путем изменения содержания трех рРНК и кинетических параметров процесса сборки рибосом.
Контроль трансляции некоторых оперонов рибосомных белков осуществляется по одинаковому механизму. Один из рибосомных белков, кодируемый полицистронной мРНК, связывается со специфической последовательностью, локализованной либо на 5'-конце мРНК, либо в начале одной из кодирующих последовательностей в середине мРНК. В обоих случаях это блокирует доступ рибосом к ближайшей инициаторной трансляционной последовательности. В зависимости от места нахождения сайта инициации трансляции мРНК-вблизи 5'-конца кодирующей последовательности или в одном из внутренних участков-блокируется трансляция всей мРНК или ее части. Контроль по типу обратной связи, при котором продукт регулирует экспрессию собственного гена, называется аутогенной регуляцией. Регуляция может осуществляться на уровне транскрипции (например, репрессорный белок сI фага l, регулирует транскрипцию соответствующего гена с PRM ) ина уровне трансляции, как в приведенном примере.
При сборке рибосом некоторые из рибосомных белков связываются с рРНК. При наличии достаточного количества рРНК вновь синтезированные рибосомные белки ассоциируют с ней, чтобы инициировать сборку рибосом. При недостатке же рРНК накапливающиеся рибосомные белки связываются с собственной мРНК вместо рРНК и соответственно блокируют собственный синтез и синтез других родственных рибосомных белков. В рез-те предотвращается накопление свободных рибосомных белков. Т.о., некоторые ключевые рибосомные белки-это репрессоры, блокирующие трансляцию кодирующей их мРНК. Одновременно они блокируют синтез и других белков, кодируемых той же мРНК. Способность рибосомных белков узнавать как рРНК, так и свою собственную мРНК связана с тем, что обе эти РНК обладают сходными нуклеотидными последовательностями. Так, последовательности, в которых рибосомные белки S8 и S7 связываются с 16S-PHK и своими собственными м РНК, имеют сходную вторичную структуру, причем петли имеют идентичные послед-ти.
Вопрос №74
Альтернативный сплайсинг – процесс, позволяющий индивидуальным генам продуцировать множество различных активных белковых изоформ.
Примеры альтернативного сплайсинга:
1) Кальцитонин и белок CGRP - различные пептиды, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга одного гена. Кальцитонин образуется в клетках щитовидной железы и является пептидным гормоном, регулирующим уровень кальция в крови. Белок CGRP – синтезируется в нейронах и является сосудорасширяющим белком, участвующем в формировании вкусовых ощущений.
2) Один из ядерных генов риса продуцирует два совершенно неродственных белка – один является митохондриальным рибосомным белком S14, второй – В-субъединицей митохондриальной сукцинатдегидрогеназы.
Вопрос №75
РНК-интерференция (RNA silensing) – это подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов) на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК (small interfering RNA, siРНК).
Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК-интерференция.
1. Фермент Дайсер связывается с dsРНК и разрезает ей на короткие фрагменты в 21-23 п.н. – siРНК (short interfering RNA).
2. siРНК связываются с ферментативным комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), который использует одну её нить (комплементарную мРНК) для связывания с мРНК.
3. Нуклеазная активность комплекса RISC деградирует мРНК.
Основные свойства РНК-интерференции:
• Специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой dsРНК).
• РНК-интерференция реализуется на посттранскрипционном уровне (фрагменты dsРНК, соответствующие последовательностям промотора или интрона не вызывали РНК-интерференцию).
• Эффект РНК-интерференции, возникший в каком-либо участке тела С. elegans может распространяться по всему организму и передаваться по наследству потомкам.
76. Генетическая инженерия – использование методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования in vitro рекомбинантных ДНК (или организмов) с заданными наследственными свойствами.
