Мир микроорганизмов разнообразен и организмы в нем различаются по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки. В соответствии с этими признаками микроорганизмы делят на 3 надцарства: эукариоты, прокариоты, вирусы.
Микроорганизмы – это невидимые простым глазом представители всех царств (бактерии, грибы, простейшие, сине-зеленые водоросли, вирусы). Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важную роль в существовании и развитии природы, в круговороте веществ, в патологии человека, животных и растений.
Эукариоты имеют дифференцированное ядро, отграниченное от цитоплазмы ядерной мембраной, аппарат митоза и ядрышко. К эукариотам относятся простейшие, дрожжи и нитчатые грибы.
Ядерная ДНК эукариотов находится в комплексе с гистонами в соотношении 1:1, хромосомы построены в виде нуклеосом, состоящих из белковых глобул, и фрагмента ДНК размером в 200 пар нуклеотидов. Эукариоты имеют рибосомы 80S, митохондрии или хлоропласты, не содержат пептидогликана, являются аэробами.
Прокариоты – это организмы, у которых нет оформленного ядра, а есть эквивалент ядра – нуклеоид, который представлен одной или несколькими хромосомами, расположенными в цитоплазме и не отграниченными от нее никакой мембраной. Прокариоты не имеют дифференцированного аппарата митоза, у них нет ядрышка. Они имеют рибосомы 70S, клеточную стенку, содержащую пептидогликан. Размеры прокариотов колеблются от 1 до 20 мкм, у них нет митохондрий и хлоропластов. Среди прокариотов есть аэробные и анаэробные организмы.
К вирусам относят организмы, у которых геном представлен ДНК или РНК, отсутствуют белоксинтезирующие системы, вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.
Систематика микроорганизмов занимается подробным описанием видов организмов, выяснением степени родства между ними, объединением их по уровню родства в классификационные единицы – таксоны. Отсюда таксономия – это наука о принципах и методах распределения организмов в иерархическом плане.
Классификация – составная часть систематики, она распределяет микроорганизмы по различным таксонам.
Основной таксономической единицей является вид.
Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение, сходный генотип, среду обитания и свойства, а также способность вызывать сходные процессы в организме человека или внешней среде.
Последующие более крупные таксономические единицы: род, семейство, порядок, класс, отдел, царство.
В настоящее время в микробиологии для классификации используется несколько основных способов.
1. Нумерический подход.
Он основан на оценке степени сходства и различия организмов по максимально возможному количеству фенотипических свойств и проявлений. Иногда проводят оценку более 100 показателей. Для увеличения достоверности определения признакам присваиваются коэффициенты (их еще называют весом). Чем более важен данный признак для определения возбудителя, чем реже он встречается у других микроорганизмов, тем выше вес признака и тем специфичнее он определяет данного возбудителя (например, продукция плазмокоагулазы у золотистого стафилококка).
2. Генетический подход.
Он основан на сходстве в строении ДНК геномов изучаемых бактерий.
Считается, что микроорганизмы, принадлежащие к 1 виду, обладают от 70 до 100% гомологией ДНК. При 60% совпадении речь может идти о принадлежности бактерий к 1 роду.
Для генетической классификации используют метод гибридизации нуклеиновых кислот, изучают процентное содержание гуанина и цитозина в ДНК генома, определяют молекулярный вес ДНК, наличие плазмид. В последнее время, особенно для внутривидовой дифференциации микроорганизмов, используют метод полимеразной цепной реакции.
3. Типирование по рибосомальной РНК (риботипирование).
Оказалось, что рибосомальная РНК бактерий содержит высококонсервативные последовательности, которые в процессе эволюции изменялись незначительно. Различия в структуре рибосомальной РНК позволяют дифференцировать крупные таксоны (порядки, классы, семейства) у бактерий.
Генетические механизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (типах) микроорганизмов, отличающихся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают: морфологические (морфовары), биологические (биовары), ферментативные (ферментовары), различные по резистентности к антибиотикам (резистенсвары) и бактериофагам (фаговары) варианты бактерий. Наряду с этим отдельные виды могут включать варианты, различающиеся по антигенной структуре (серовары), экологическим нишам, в которых они обитают (эковары) и патогенности для определенных хозяев (патовары).
Штаммом называют культуру одного вида микроорганизмов, выделенную из различных источников (организма человека, животного, окружающей среды) или из одного и того же источника, но в разное время. Обычно штаммы обозначают протокольными номерами или называют либо по источнику выделения (водный, кишечный), либо по местности, где он был выделен. Штаммы микробов одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по степени вирулентности, метаболической активности, чувствительности к антибиотикам и антисептикам, однако свойства отдельных штаммов не выходят за пределы данного вида микроорганизмов.
Согласно биноминальной номенклатуре каждый микроорганизм имеет название, состоящее из двух слов: первое слово означает род и пишется с прописной буквы, второе слово означает вид и пишется со строчной буквы, например Escherichia coli. Возможно сокращение рода до первой буквы, реже встречаются сокращения до первых двух или трех букв. Достаточно часто используют только родовое название, имея в виду все виды данного рода, или то, что идентификация проводилась только до рода. Вместо видового названия в этом случае используют сокращение: spp.
Клон – культура микроорганизмов, полученная из одной особи.
Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида, выращенные на питательной среде.
Особенности микроорганизмов определили набор признаков и свойств, которые используются в систематике и классификации:
1. Морфологические – величина, форма, взаимное расположение.
2. Тинкториальные – способность окрашиваться различными красителями при сложных методах окрашивания. Одним из наиболе важных признаков является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического строения клеточной стенки. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные.
3. Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах.
4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии разделяются на ползающие и плавающие, у которых подвижность связана с наличием жгутиков.
5. Физиологические свойства – способы питания, дыхания.
6. Биохимические свойства – способность расщеплять белки, углеводы, жиры до конечных продуктов обмена.
7. Чувствительность к специфическим бактериофагам.
8. Антигенные свойства (выявляют в иммунологических реакциях).
9. Липидный, белковый и углеводный состав. Белковые спектры определяют с помощью метода двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, где разделяют смеси рибосомных, мембранных и внутриклеточных белков, получая белковые спектры соответствующей фракции определенного вида бактерий. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии.
10. Генетические свойства. Их изучают, используя методы геносистематики. Наиболее точным методом установления генетического родства является определение степени сходства ДНК.
Молекулярно-биологические признаки основываются на гомологии эталонной и исследуемой ДНК, о которой судят по процентному содержанию гуанин-цитозин (Г+Ц)-пар или по степени гибридизации этих молекул. Химическими методами после гидролиза ДНК и разделения свободных оснований можно узнать нуклеотидный состав. Наиболее часто используется определение точки плавления ДНК, при которой происходит ее денатурация в результате разрыва водородных связей, соединяющих две цепи. Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптической плотности при 260 нм. Если она достигает 90% и выше, говорят о близком генетическом родстве эталонной ДНК с выделенной из исследуемого микроба. Содержание Г+Ц в ДНК можно измерить также путем центрифугирования образца ДНК в градиенте хлорида цезия. ДНК. Наибольшее разнообразие в содержании Г+Ц наблюдается в группе прокариотов, у которых эта величина колеблется от 30 до 75%, но среднее содержание Г+Ц у многих различных штаммов микроорганизмов одного вида очень близко или идентично. В то же время два организма с одинаковым средним нуклеотидным составом ДНК могут резко различаться в генетическом отношении.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет точно оценить генетическую гомологию штаммов. При быстром охлаждении раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации, ее одиночные цепи остаются разделенными. Однако при температуре на 10-300С ниже точки плавления происходит специфическая реассоциация («отжиг») комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул. Может быть проведена аналогичная реассоциация между молекулами ДНК и РНК, реассоциация «ДНК-рибосомальная РНК» представляет таксономический интерес.
Обычно при гибридизации нуклеиновых кислот используют образцы ДНК с радиоактивной меткой. На этом признаке основан метод молекулярных зондов, применяемый с диагностическими целями. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после этого определяется степень его гомологии с исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить наличие в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить микробиологический диагноз заболевания.
В таксономии микроорганизмов международное признание получил определитель бактерий, изданный Д. Берги (1923 г.), который впоследствии неоднократно переиздавался.
Определитель выделяет грамположительные и грамотрицательные бактерии; эубактерии, лишенные клеточной стенки (микоплазмы); архебактерии (метан- и сульфатредуцирующие архебактерии, галофильные и термофильные архебактерии и архебактерии, лишенные клеточной стенки).
Прокариоты включают царства Eubacteria и Archaebacteria. В них входят отделы.
Отдел I. Gracilicutes, к нему относятся грамотрицательные бактерии.
Отдел II. Firmicutes, к нему относятся грамположительные бактерии.
Отдел III. Tenericutes – организмы, не имеющие клеточной стенки (сюда относятся микоплазмы).
Отдел IV. Mendosicutes – бактерии, у которых в клеточной стенке нет пептидогликана.
Для удобства использования определителя описание отделов дается по группам.
Патогенные для человека бактерии входятв достаточно небольшое число групп.
Группа 1. Спирохеты. Включает свободноживущие и паразитические виды; для человека патогенными являются представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira.
Группа 2. Аэробные и микроаэрофильные подвижные извитые и изогнутые грам(-) бактерии. Патогенные для человека виды входят в роды Campylobacter, Helicobacter и Spirillum.
Группа 3. Неподвижные (редко подвижные) грамотрицательные бактерии (не содержит патогенные виды).
Группа 4. Грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки. Патогенные для человека виды включены в состав семейств Legionellaceae, Neisseriaceae и Pseudomonadaceae; в группу входят также патогенные и условно-патогенные бактерии родов Acinetobacter, Afipia, Alcaligenes, Bordetella, Brucella, Flavobacterium, Francisella, Kingella, Moraxella.
Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки. Образована тремя семействами – Enterobacteriaceae, Vibrionaceae и Pasteurellaceae, каждое из которых включает патогенные виды, а также патогенные и условно-патогенные бактерии родов Calymmobacterium, Cardiobacterium, Eikenella, Gardnerella и Streptobacillus
Группа 6. Грамотрицательные анаэробные прямые, изогнутые и спиральные бактерии. Патогенные и условно-патогенные виды входят в состав родов Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas и Prevotella.
Группа 7. Бактерии, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфата или серы. Не включает патогенные виды.
Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки. Включает условно-патогенные бактерии рода Veillonella.
Группа 9. Риккетсии и хламидии. Три семейства – Rickettsiaceae, Bartonellaceae и Chlamydiaceae, каждое из которых содержит патогенные для человека виды.
Группы 10 и 11. Включают анокси- и оксигенные фототрофные бактерии, непатогенные для человека.
Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы. Объединяет серо-, железо- и марганецокисляющие и нитрифицирующие бактерии (не вызывают поражений у человека).
Группы 13 и 14. Включают почкующиеся и/или бактерии с выростами и бактерии, обладающие чехлом. Представлены свободноживущими видами, непатогенными для человека.
Группы 15 и 16 Объединяют скользящие бактерии, не образующие плодовых тел, и скользящие бактерии, образующие плодовые тела (непатогенны для человека).
Группа 17. Грамположительные кокки. Включает условно-патогенные виды родов Enterococcus, Leuconostoc, Peptococcus, Peptostreptococcus, Sarcina, Staphylococcus, Stomatococсus и Streptococcus.
Группа 18. Спорообразующие грамположительные палочки и кокки. Включает патогенные и условно-патогенные палочки родов Clostridium и Bacillus.
Группа 19. Неспорообразующие грамположительные палочки правильной формы. Включает условно-патогенные виды родов Erysipelothrix и Listeria.
Группа 20. Неспорообразующие грамположительные палочки неправильной формы. В состав группы входят патогенные и условно-патогенные виды родов Actinomyces, Corynebacterium, Gardnerella, Mobiluncus и др.
Группа 21. Микобактерии. Включает единственный род Mycobacterium, объединяющий патогенные и условно-патогенные виды.
Группы 22-29. Актиномицеты. Среди многочисленных видов лишь нокардиоформные актиномицеты (группа 22) родов Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Jonesia, Oerskovia и Terrabacter способны вызывать поражения у человека.
Группа 30. Микоплазмы. Патогенны для человека виды, включенные в состав родов Acholeplasma, Mycoplasma и Ureaplasma.
Не содержат патогенных для человека видов – метаногенные бактерии (группа 31), сульфатредуцирующие бактерии (32), экстремально галофильные аэробные археобактерии (33), археобактерии, лишенные клеточной стенки (34), и экстремальные термофилы и гипертермофилы, метаболизирующие серу (35 группа).
2.2. Структура бактериальной клетки и химический состав микроорганизмов
Бактерии I и II отделов – это простейшие одноклеточные организмы, не имеют хлорофилла. Содержат нуклеиновую кислоту, белки, полисахариды, липиды, минеральные вещества, воду, микроэлементы. У них всегда присутствуют оболочка, цитоплазма, нуклеоид и рибосомы. Не у всех бактерий имеются капсула, жгутики, фибриллы, пили, споры, включения и плазмиды.
Все эти структуры выявлены различными методами. Их величину определяют ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, микроскопией с использованием микрометра. Она колеблется от 0,1 нм до 10-20 нм (1000 нм=1 мкм; 1000 мкм=1 мм).
Оболочка бактерий состоит из трех слоев: слизистого (поверхностного), собственно клеточной стенки и ЦПМ – цитоплазматической мембраны.
Слизистый слой располагается поверх клеточной стенки, состоит из высокополимерных мукополисахаридов, которые не имеют с клеточной стенкой постоянной и прочной связи.
Клеточная стенка бактерий и грибов располагается между цитоплазматической мембраной и капсулой (если она имеется) или ионизированным слоем внешней среды (рис. 1 и 2).
Толщина клеточной стенки колеблется от 10 до 35 нм. Клеточная стенка составляет 10-50% сухой массы бактерий, построена из полимеров или блоков, включающих липопротеиды, липополисахариды, протеины, тейхоевые кислоты.
Главным и специфичным для клеточной стенки компонентом является муреин или пептидогликан. Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогликан включает в себя остов и два набора пептидных цепочек – боковых и поперечных. Остов состоит из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, связанных между собой b-гликозидными связями. Основу пептидов связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D-аминокислот, например, L-аланин-D-глютаминовая кислота- мезодиаминопимелиновая кислота-D-аланин.
В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая кислота – уникальный компонент клеточной стенки, который имеется только у прокариотов.
У грамотрицательных бактерий клеточная стенка слоиста. Внутренний слой построен из пептидогликана (5-10%), не содержит тейхоевых кислот. Наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с цитоплазматической мембраной. Основной компонент этих мембран – двойной слой липидов. Наружная мембрана представлена липополисахаридами, фосфолипидами и белками. В состав белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных («мажорных»), которые составляют 70% суммарных белков наружной мембраны; два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидогликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки участвуют в облегченной диффузии и активном транспорте молекул, участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорских ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления.
С внешней её стороны располагается липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, базисной части (ядра) и О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями.
ЛПС грамотрицательных бактерий обладает токсическими свойствами (связан с эндотоксином) и выраженными антигенными свойствами (О-антиген определяет серогруппу, серовар), по которым можно дифференцировать бактерии. Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза и обладают пирогенным действием.
Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она толще, чем у грамотрицательных бактерий – 20-60 нм. У грамположительных бактерий клеточная стенка на 60-90% состоит из пептидогликана и тесно связанных с ним тейхоевых кислот. Тейхоевые кислоты (от греч. teichos – стенка) – растворимые в воде линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибитола, связанные между собой фосфодиэфирными связями.
Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генцианфиолетовый в комплексе с иодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с краской. Обработка окрашенного по Граму мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидогликане и задержку красителя в клеточной стенке. Наоборот, грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются, поры остаются открытыми и при обработке фуксином бактерии окрашиваются в красный цвет.
Клеточная стенка выполняет следующие функции:
- определяет и сохраняет постоянную форму микробной клетки;
- является осмотическим барьером, защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды;
- имеет своеобразное строение в виде «сита», через ее поры в клетку проникают питательные вещества, а из клетки выделяются продукты метаболизма, токсины, ферменты;
- участвует в регуляции роста и деления клеток;
- в клеточной стенке находятся гидролитические ферменты. Они обеспечивают рост клеточной стенки, а при гибели - аутолиз её;
- защищает клетку от неблагоприятных воздействий (температура, химические вещества);
- в ней локализуются основные антигенные детерминанты для взаимодействия со специфическими антителами и бактериофагами;
- имеет сложный химический состав, который позволяет дифференцировать клетки на грамположительные и грамотрицательные;
Способы выявления клеточной стенки:
- опыт Фишера – клетку помещают в гипертонический раствор соли или сахара. Вещества из клетки выходят в сторону большего осмотического давления – клеточная стенка отслаивается от цитоплазмы и видна в световом микроскопе;
- электронная микроскопия и ультрацентрифугирование с учетом по константе седиментации;
- действие лизоцима или антибиотиков приводит к растворению клеточной стенки.
Пептидогликан может разрушаться под действием фермента лизоцима (мурамидазы), гидролизующего связи между ацетилглюкозамином и ацетилмурамовой кислотой.
Если клеточная стенка полностью разрушается – образуются протопласты или L-формы бактерий. В отличие от протопластов, L-формы способны размножаться. Они бывают стабильные, если не восстанавливаются в исходную форму, и нестабильные (восстанавливаются). Если клеточная стенка растворяется частично, то образуется сферопласт.
Цитоплазматическая мембрана. Цитоплазматическая мембрана имеет три слоя – двойной фосфолипидный и глобулярный белковый. Она ограничивает цитоплазму, поддерживает постоянство осмотического давления, необходимого для нормального метаболизма клетки, контролирует водный и солевой обмен, обеспечивает питание бактерий за счет ферментов-пермеаз, расположенных в ЦПМ. За счет окислительно-восстановительных ферментов ЦПМ принимает участие в процессах дыхания. ЦПМ участвует в делении клетки, биосинтезе компонентов клеточной стенки и капсулы, в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид.
Имеется система внутренних мембран – мезосомы – это аналоги митохондрий. Они являются производными ЦПМ, связаны с нуклеоидом. Принимают участие в делении клеток, в распределении дочерних нуклеоидов в делящихся клетках, участвуют в спорообразовании, в синтезе материала клеточной стенки, в энергетическом метаболизме.
Цитоплазма – это коллоидная масса, заключенная в оболочку. Химический состав её сложный (белки, полисахариды, липиды, РНК, микроэлементы, минеральные вещества).
В электронном микроскопе в цитоплазме выявлены: эндоплазматическая сеть, рибосомы и гранулярные образования.
Рибосомы – структуры, в которых идет синтез белка. В свободном состоянии рибосомы могут находиться в виде 2 субъединиц с константой седиментации 30S и 50S. Перед синтезом белка субъединицы объединяются в рибосому с константой седиментации 70S. Количество рибосом в клетке колеблется от 5 до 10000. Часто они группируются в полисомы – полирибосомы.
Гранулы гликогена, крахмала, жира, зерна волютина (полифосфаты) играют трофическую и диагностическую роль (у дифтерийной палочки зерна волютина располагаются по полюсам и интенсивно прокрашиваются «метахромазия»). В цитоплазме могут быть плазмиды – участки дополнительного генетического материала, представленные двойной нитью ДНК, обеспечивающие определенные свойства бактерий (см. в разделе генетики бактерий).
Нуклеоид (хромосома). Нуклеоид бактерий содержит циркулярно-замкнутую двойную нить ДНК, располагается в цитоплазме в виде клубка. У нуклеоида нет ядерной оболочки, ядрышек, белков гистонов и протаминов; при этом микробная клетка не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата.
В нуклеоиде есть ДНК, РНК и ферменты, в частности РНК-полимераза. РНК и РНК-полимераза находятся в центре, а на них намотана ДНК, которая расположена компактно. Один конец ДНК связан с мезосомами ЦПМ, что способствует разделению дочерних хромосом при репликации. Бактерии – гаплоидные существа. Содержат 1 молекулу ДНК, ее можно рассматривать как одиночную хромосому, в расправленном состоянии ее длина 1 мм.
Форма нуклеоида различна: сферическая, палочковидная, подковообразная. В клетке в зависимости от физиологического состояния может быть один или кратное двум количество нуклеоидов. В молодых клетках – несколько, в старых – 1, у кокков – 1, у палочковидных – много.
Функции нуклеоида: хранитель генетической информации, которая закодирована в ДНК; принимает участие в генетических процессах (мутациях, рекомбинациях), а также в делении бактерий и спорообразовании.
Доказательства наличия нуклеоида:
– цитохимическая реакция Фельгена на ДНК. На мазок бактерий наносят соляную кислоту, при этом из дезоксирибозы образуются альдегиды, которые с фуксинсернистой кислотой реактива Шиффа дают фиолетовое окрашивание;
– люминесцентная микроскопия: при окраске мазка акридиновым оранжевым ДНК в ультрафиолете светится зеленым светом, РНК – красным;
– электронная микроскопия ультратонких срезов.
Жгутики – органы передвижения бактерий. Это тончайшие длинные нити (3-5х12-25 нм), одетые чехлом белковой природы, берут начало в цитоплазме и связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный диск находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков, обладает высокой антигенной активностью и специфичностью (см. Н-антиген).
Для изучения жгутиков существуют прямые и косвенные методы. Прямые – это электронная микроскопия и световая после окраски по Лёффлеру. Косвенные – посев уколом в столбик полужидкого агара и микроскопия нативного материала в препаратах «висячая» и «раздавленная» капли в световом и фазово-контрастном микроскопах.
По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на монотрихи – имеют 1 жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи – по одному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перитрихи – жгутики по всей поверхности тела клетки, атрихи – без жгутиков.
Помимо жгутиков есть ворсинки (пили, бахромки) – это органы прикрепления. Наиболее изучены 2 вида пилей – половые (sex) пили, через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюгации, и пили, обеспечивающие прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина.
Фибриллы (периплазматические жгутики) – органы передвижения у спирохет, они состоят из отдельных переплетающихся нитей и располагаются между клеточной стенкой и ЦПМ.
Споры – покоящиеся формы жизненного цикла бактерий, образуются внутри цитоплазмы вегетативных клеток в неблагоприятных условиях существования и обеспечивают сохранение вида. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза. Микробы, образующие споры, называются бациллами (аэробы) или клостридиями (анаэробные бактерии, имеющие форму веретена). Споры отличаются от вегетативной клетки тем, что происходит репрессия генома и клетка переходит в состояние анабиоза, при котором отсутствует обмен веществ, вода переходит из свободного состояния в связанное, повышается концентрация ионов кальция, появляется дипиколиновая кислота, которая обусловливает термоустойчивость споры.
Процесс спорообразования сходен у большинства бактерий. Вначале образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Затем в ЦПМ образуется инвагинация, разделяющая клетку на 2 протопласта, каждый из которых содержит 1 хромосому. Меньший из протопластов – проспора (предспора) – покрывается второй оболочкой, которая синтезируется мембраной материнской клетки. В оболочке клетки содержится дипиколиновая кислота и ионы кальция. Далее между двумя листками мембраны формируется специфический для споры кортикальный слой (кортекс), состоящий из пептидогликана, который отличается по составу от пептидогликана клеточной стенки. Снаружи спора покрывается толстой рыхлой оболочкой – экзоспориумом, содержащей немного углеводов. Белковая оболочка споры богата остатками цистеина и лизина и обладает гидрофобностью. После этого наступает аутолиз вегетативной клетки.
При попадании споры в благоприятные условия происходит активация споры и ее прорастание в вегетативные клетки. Идет дерепрессия генома, мобилизация метаболических процессов, из клетки удаляется дипиколиновая кислота, ионы кальция, разрушается пептидогликан кортекса.
Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста.
Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществляется различными воздействиями: снижением рН, веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим повреждением спор.
Начальная стадия: происходит активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, выходит дипиколинат кальция.
Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры появляется вегетативная клетка, которая при наличии питательных веществ удваивает свою биомассу, делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов.
Для обнаружения спор используют электронную микроскопию, а также специальный метод окраски по Ожешко, на первом этапе которого нефиксированный мазок обрабатывают в течение 1-2 минут 0,5% р-ром HCl при подогревании, а далее препарат окрашивают по методу Циль-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий. При простых методах окраски оболочка не пропускает красители, споры сильно преломляют свет и видны в микроскопе как прозрачные зерна.
Капсула – структура бактериальной клетки, которая расположена на поверхности клеточной стенки и тесно связана с ней. Она состоит из высокогидрофильных мицелл гетерополисахаридов (у кишечных бактерий), белков (у стрептококков), полипептидов (бацилл сибирской язвы). В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с телом различают капсулу или макрокапсулу, которая видна в световом микроскопе, микрокапсулу (К-антиген), которая выявляется при электронной микроскопии, серологическими и химическими методами, и слизистый слой, который непрочно связан с клеточной стенкой и состоит из экстрацеллюлярных веществ микроба.
У некоторых бактерий капсула постоянна, содержится у всех особей и во всех средах (Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes). У пневмококков, возбудителей сибирской язвы, C. perfringens капсульное вещество образуется только в макроорганизме, а на питательных средах синтез его прекращается. Капсула является важным фактором вирулентности, защищает бактерии от действия фагоцитов, связывает ионы тяжелых металлов, защищает от действия антител, комплемента и от высыхания. Определение капсулы используют для классификации и идентификации бактерий и установления их вирулентности. Капсула выявляется при специальных методах окраски (метод Бурри-Гинса), создающих негативное контрастирование вещества капсулы тушью.
Морфология бактерий
Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах (мкм). Они варьируют в широких пределах от 0,1-0,15 (микоплазмы) до 10-15 мкм (клостридии) в длине и от 0,1 мкм до 1,5-2,5 мкм в диаметре.
Бактерии бывают шаровидные (сферические), палочковидные (цилиндрические), извитые (спиралевидные), нитевидные и ветвящиеся.
Кокки – шаровидные клетки, которые в зависимости от взаимного расположения делятся на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины, стафилококки (рис. 3). Микрококки располагаются в виде отдельных клеток, делятся в одной плоскости, сапрофиты, патогенных для человека нет. Диплококки, или парные кокки, располагаются парами (пневмококк, гонококк, менингококк), так как клетки после деления не расходятся. Пневмококк (возбудитель пневмонии) имеет ланцетовидную форму, а гонококк (возбудитель гонореи) и менингококк (возбудитель менингоккоковой инфекции) – форму кофейных зерен, обращенных вогнутой поверхностью друг к другу. Стрептококки (от греч. streptos – цепочка) – клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними в месте деления. Многие стрептококки являются патогенными для человека и вызывают различные заболевания: скарлатину, ангину, гнойные воспаления и другие. У тетракокков (от лат. tetra – четыре) деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием тетрад. Патогенные для человека виды встречаются очень редко. Сарцины (от лат. sarcina – связка, тюк) располагаются в виде пакетов из 8 и более кокков, которые образуются при делении клеток в трех взаимно перпендикулярных областях. Среди них имеются условно патогенные представители. Особенно часто встречаются в воздухе. Стафилококки (от греч. staphyle – виноградная гроздь) представляют собой кокки, расположенные группами (гроздьями) в результате деления в разных плоскостях.
Палочковидные бактерии различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Длина клеток варьирует от 1 до 8 мкм, толщина – от 0,5 до 2 мкм. Термин «бактерия» (от греч. bacteria – палочка) применяется как для названия всех царства прокариотов, так и для названия палочек, не образующих спор. Палочки, образующие споры, подразделяют на бациллы (от лат. bacillus – палочка) – аэробные спорообразующие бактерии, например, Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы и клостридии (от лат. сlostridium – веретенообразный) – анаэробные спорообразующие бактерии, например, Сlostridium tetani – возбудитель столбняка. Палочки могут быть правильной (кишечная палочка и др.) и неправильной (коринебактерии и др.) формы, в том числе ветвящиеся, например, актиномицеты. Наиболее мелкие палочковидные бактерии – риккетсии. Концы палочек могут быть как бы обрезанными (сибиреязвенная бацилла), закругленными (кишечная палочка), заостренными (фузобактерии) или в виде утолщения, и тогда палочка похожа на булаву (коринебактерии дифтерии). Большинство палочковидных бактерий располагается беспорядочно, так как после деления клетки расходятся. Если после деления клетки остаются связанными общими фрагментами клеточной стенки и не расходятся, они располагаются под углом друг к другу (коринебактерии дифтерии), образуют цепочку (сибиреязвенная бацилла). По взаимному расположению бактерии подразделяют на три группы:
– монобактерии – палочки располагаются одиночно и беспорядочно, сюда относится большинство палочковидных бактерий;
– диплобактерии располагаются попарно (род Pseudomonas);
– стрептобактерии или стрептобациллы – бактерии располагаются цепочкой.
Извитые формы – спиралевидные бактерии, по количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток подразделяют на три группы:
– вибрионы (от греч. vibrio – извиваюсь), имеют один изгиб, не превышающий четверти оборота спирали (Vibrio cholerae – возбудитель холеры);
– спириллы, имеющие вид штопорообразно извитых клеток. К патогенным спириллам относятся кампилобактерии и хеликобактерии, возбудитель содоку (болезни укуса крыс;
– спирохеты в сравнении со спириллами имеют большее количество равномерных или неравномерных завитков. Выделены в особый порядок Spirochaetales
Нитевидные и ветвящиеся формы бактерий. Различают два типа нитевидных бактерий, которые образуют временные или постоянные нити. Временные нити с ветвлениями образуют палочковидные бактерии при нарушении регуляции клеточного деления (микобактерии, коринебактерии). При восстановлении механизма регуляции деления эти бактерии восстанавливают обычные размеры. Постоянные нитевидные формы образуют палочковидные бактерии, которые соединяются в длинные цепочки или с помощью слизи, или чехлами, или мостиками.
Нитевидные формы образуют актиномицеты, серобактерии и железобактерии.
Бактерии отличаются полиморфизмом (индивидуальная изменчивость формы, не передающаяся по наследству) при культивировании на искусственных питательных средах и под воздействием химических веществ и антибиотиков.
