Клональное микрорлзмножение растений

Клональное микроразмножение - получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных ис­ходному экземпляру - принципиально новый метод вегетативного размножения. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Преиму­щества над традиционными способами размноже­ния:

· получение генетически однородного посадочного материала;

· освобождение растений от вирусов;

· высокий коэффициент размножения. (Ю⁵.: Л0^б - для травяни­стых, цветочных растений, 10⁴..,10⁵ ~ для кустарниковых древесных, 10⁴ — для хвойных);" '

· сокращение продолжительности селекционного процесса;

· ускорение перехода растений от ювекильной к репродуктив­ной фазе развития;

· размножение растений, трудно размножаемых традиционны­ми способами;

· возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала:

· возможность автоматизации процесса выращивания.

Методы размножения растений

Процесс клонального микроразмножения разделяют на четыре этапа:

1. выбор растения - донора, изолирование зкеняантов и получе­ние хорошо растущий стерильной культуры;

2. собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов;

3. укоренение размноженных побегов и приспособление-их к поч­венным условиям;

4. выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений этот процесс можно осуществлять следующими; метода­ми:

- активизацией развития уже существующих в растении мери­стем;

- индукцией соматическою эмбриогенеза;

- дифференциацией адвентивных ночек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Первый метод используемый при клональном микроразмножении растений - это активация развитии уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:

- удаление верхушечной меристемы стебля и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде;

- добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.

Второй метод - это индукция возникновения адвентивных непосредственно тканями зкспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким об­разом регенерировать целые растения. Образования адвентивных почек возможно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции.

Таким образом, от одного материнского растения можно полу­чать несколько миллионов раетений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый ври клональном микроразмножении, основывается на дифференциациииз соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил назва­ние соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня.

Четвертый метод клонального микроразмножения - диффе­ренциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллус­ной ткани. Практически он мало используется для получения по­садочного материала in vitro, т.к. при периодиче­ском пересаживании каллусной ткани часто наблюдаются нежелательные изменения плоидности культивируемых клеток, структурные пере­стройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетиче­скими изменениями наблюдаются изменения и по морфоло­гии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их располо­жение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоуз­лий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредите­лям

Однако данный метод име­ет свои положительные стороны и преимущества. Во-первых, он эффективен и экономически выгодный, т.к. в процессе раз­множения из каждой индивидуальной каллусной клетки может сформиро­ваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом й размножения растений в культуре тканей. В-третьих - представляет большой интерес для селекционеров, т.к. растения полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга.

Питательные среды. Любая питательная среда включает в себя: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, регуляторы роста гормональной природы.

Обязательным условием является присутствие в среде кроме эле­ментов питания гормональных факторов или имитаторов их действия. Известно пять групп соединений, относящихся к категории фитогормонов. Это цитокинины, ауксины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. При in vitro было выявлено, что для пре­вращения специализированной клетки в меристематическую, способ­ную к делению, необходимо участие двух и более гормонов, относя­щихся к разным группам.

Условия культивирования. После тщательного перемешивания компонентов питательной среды регулируется рН всей смеси путем до­бавления 0,1 N NaOH и 0,1 N НС1.

Факторы окружающей среды, такие как свет, температура и со­став воздуха, влияют на рост и развитие клеток в культуре орга­нов и тканей. Действие этих факторов взаимосвязано.

Процесс микроразмножения растений состоит из трех этапов:

- эксплантирование исходного материала,

- собственно микроразмножение,

- укоренение размноженных побегов.

При получении посадочного материала дре­весных растений методом микроклонирования можно выделить и четвертый этап

- адаптации регенерантов к нестерильным условиям среды.

Отбор экстантов и введение их в культуру. Для микрораз­множения древесных растений используют два основных типа исход­ного материала:

- ювенильный (семена и их отдельные части, а также части про­ростков);

- молодые ткани взрослых растений (почки, хвоя, ткани листа, побеги).

Перед введением в культуру материал стерилизуют. Стерилизующие растворы могут быть разделены на несколько групп. Первая из них включает растворы, содержащие активный хлор: хлорамин, хлорная известь, гипохлорит кальция и гипохлорит натрия. Вторая группа включает ртутьсодержащие растворы, обладающие наибольшим дезинфицирующим эффектом: хлорид ртути и диацид. Растворы второй группы используют в тех случаях, когда препа­раты первой группы оказались неэффективными.

Перед высадкой на питательную среду материал ополаскивают в стерильной воде.

Мультипликация побегов. При правильно подобранной пита­тельной среде, надежной стерилизации и подходящих условиях культивирования в пробирке или колбе образуется несколько побегов. Часть из них пересаживают на новую среду для образования корней, а другую повторно культивируют для увеличения количества побегов. Этот процесс повторяют многократно до получения требуемого количества посадочного материала.

Ризогенез. Питательная среда для культивирования побегов с целью образования на них корней отличается от среды, которая использовалась на первом этапе. Для многих растений необходимо использовать среду с низким содержанием солей. Время, необходимое для формирование корней, варьирует от 10 до 15 дней. Растения из пробирки пересаживают, когда корни достигнут 5 мм длины. Более длинные корни могут при пересадке поломаться.

Адаптация к нестерильным условиям среды. Для переноса рас­тений из культуральных сосудов в почву требуется особая осторож­ность. Корни промываются для удаления налипшей на них питательной среды. Первые 10-15 дней в теплице поддерживается высокая влажность (90-100%).

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным усло­виям наиболее дорогостоящая и трудоемкая операция. Не­редко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в рос­те, опадение листьев и гибель растений. Это связано во первых с тем, что у растений нарушается деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количе­ства воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не про­исходит образования корневых волосков, из-за этого, нарушается поглощение воды и минеральных солей из почвы. Поэтому на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применяется искусственная микоризация растений (для микотрофных), учитывая положительную их роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите расте­ний от патогенов. Существует два способа заражения растений микоризообразующими грибами, in vitro (в стерильных условиях); in vivo (в естественных условиях). Первый способ более благоприятен, так как в этом случае исключается возможность загрязнений почвы, другими микроорганизмами.

Оздоровление посадочного материала

Преимущество клонального микроразмножения - это получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Это возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфек­ции.

Строение точки роста растений имеет свою специфику: дистальная её часть, представленная апикальной меристемой, у разных рас­тений имеет средний диаметр до 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы об­разуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчиваю­щийся получением целого нормального пробирочного растения.

Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений что, подтверждает что количество лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно мало и многие меристемы пораженных растений инфекционны.

Таким образом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами расте­ний оказывается низкой.

В принципе возможно получение безвирусной апикальной ме­ристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть дос­тигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vitvo, так in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специ­альные термокамеры, где в течение первой недели повышают темпе­ратуру от 25 до 37°С путем ежедневного увеличения параметров тем­ператур на 2°С. Важно при термотерапии создавать и под­держивать оптимальные режимы: тем­пературу 37°С, освещенность лампами дневного света 5 тыс. лк, фото­период 14...16 ч в сутки при относительной влажности воздуха в термокамере 90%. Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости.

Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, - хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина - 1в...-Д-рибофуранозил - 1, 2, 4 - триазол-З-карбоксимид (коммер­ческое название вирозол) концентрацией 20...50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При его использовании в культуральной среде процент безвирусных меристемных расте­ний для ряда обычных для этих растений вирусов увеличивался до 80... 100% при 0...41% в контроле.

Возраст исследуемого материала. Возраст первичного экспланта существенно влияет и на укоренение микропобегов, размноженных in vitro. С увеличением возраста исходного материала, как правило, сни­жается способность побегов к укоренению.

Несомненно, с практической точки зрения целесообразно раз­множать растения, и в частности древесные, в возрасте старше 20 лет. Однако размножение их in vitro в таком возрасте представляет большие трудности. Во-первых, все типы тканей и органов у взрослых растений эндогенно заражены грибами и бактериями, что значительно затрудняет получение асептической культуры. Во-вторых, почки или другие органы одного и того же взрослого дерева различаются между собой по поведению в условиях in vitro гораздо больше, чем это имеет место у травянистых растений, что приводит к проведению специальных экспериментов по подбору оптимальных условий куль­тивирования, обеспечивающих нормальный рост и развитие вновь введенных эксплантов в культуру.

В настоящее время преодоление возрастного барьера осуществ­ляется путем реювенилизации - сочетание работ in vivo и in vitro. Реювенилизацию (омоложение) можно проводить несколькими путя­ми:

- многократной обработкой растущего дерева или отдельных ветвей раствором цитокинина перед эксплантированием;

- повторным черенкованием;

- частой подрезкой деревьев для индукции роста побегов непо­средственно из ствола дерева или для стимуляции корневых отпры­сков;

- проведением повторных прививок;

- путем серии субкультивирований (in vitro);

- созданием густых насаждений, обеспечивающих боковое зате­нение, которое будет стимулировать развитие спящих почек.

Итог

Клональное микроразмножение растений является новым перспективным спосо­бом вегетативного размножения, позволяющим получать генетиче­ски однородный, оздоровленный посадочный материал, иметь вы­сокий кооффициент размножения, сокращать селекционный процесс, проводить работы в течение года, экономя при этом площади, не­обходимые для выращивания растений. Во многих странах мира биоиндустрия микроклонального размножения поставлена на поточ­ную промышленную основу и представлена десятками активно функ­ционирующих предприятий. В настоящее время многие научно-следовательские институты и про­мышленные лаборатории разрабатывают и усовершенствуют методы микроразмножения и оздоровления различных декоративных, плодо­вых, ягодных, овощных, кормовых и древесных культур.